羟自由基ELISA测定试剂盒

                                 羟自由基测定试剂盒说明书 

本试剂盒仅用于科研、实验室

50T/48样
一、测定原理：
Fenton 反应是最常见的产生羟自由基的化学反应，H2O2的量和Fenton反应产生的OH·
量
成正比，当给予电子受体后，用griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与OH·的多少成正
比关系。
二、试剂组成与配制：(50T/48 样)
试剂一：3%H2O2标准品贮备液 0.５ml×１支，4℃保存 3 个月。
0.03％标准品应用液的配制：3%H2O2标准贮备液∶双蒸水＝１∶99 稀释，现用现配。
试剂二：底物贮备液 1ml×１支，４℃保存 3 个月。
底物应用液的配制：
①、若您的样本为抑制羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度低，
则底物应用液的配制：底物贮备液∶双蒸水＝１∶99 稀释，现用现配。
②、若您的样本为产生羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度高，
则底物应用液的配制：底物贮备液∶双蒸水＝１∶299 稀释，现用现配。
试剂三：甲液贮备液２ml×１支，４℃保存 3 个月，用时加双蒸水 1∶9 稀释成应用液。
乙液７ml×２支，４℃保存 3 个月。
试剂三应用液的配制：甲液应用液与乙液等比例混合，用多少配多少，余下４℃保存。
试剂四：液体 10ml×１瓶，４℃保存 3 个月。用时加双蒸水稀释至 100ml，制备成应用液 ．．．，
４℃保存。若有结晶，则放置 37℃水浴至全部溶解后再稀释。
试剂五：液体 30ml×１瓶，避光 4℃冰箱保存 3 个月。
试剂六：液体 30ml×１瓶，避光 4℃冰箱保存 3 个月。
试剂七：分析纯的冰乙酸（冰醋酸）自备。
显色剂的配制：试剂四 ．．．应用液 ．．．∶试剂五∶试剂六∶冰乙酸＝８∶３∶３∶２，现用现配。
[注]： 抑制羟自由基的物质如：血清（浆）、各种组织匀浆液、口服液等；
产生羟自由基的物质如：中性白细胞、某些药物、部分植物等。
三、操作步骤：
以上配制好的应用液，先在 37℃水浴中预温 3 分种，以下操作在 37℃水浴中进行。
空白管 标准管 对照管 测定管
双蒸水（ml） 0.4 0.2 0.2
0.03% H2O2标准应用液（ml） 0.2
底物应用液（ml） 0.2 0.2
样本*（ml） 0.2
试剂三应用液（ml） 0.4 0.4 0.4 0.4
混匀，37℃反应１分钟（准确以秒表计时），从加完试剂三开始到一分钟结束，立即加
入显色剂终止反应，一次只能做一只管子。
显色剂（ml） ２ 2 2 ２
混匀，室温放置 20 分钟后，１cm 光径， 550nm，双蒸水调零，测各管吸光度值。
1
本试剂盒仅用于科研、实验室
*：参考取样量：血清（浆）样本用生理盐水 20 倍稀释后取 0.2ml 作检测；若您有精确微量
移液器，可直接取 0.010ml 血清（浆），再加 0.190ml 生理盐水。组织匀浆
上清，取样 0.2ml 检测。具体取样量需根据预试结果确定，详细预试方法见
附录。
四：计算及举例：
（一）、血清（浆）中抑制羟自由基能力的计算：
1、 定义：规定每毫升血清（浆）在 37℃下反应 1 分钟，使反应体系中H2O2浓度降低 1mmol/L
为一个抑制羟自由基能力单位。
2、公式:
1
(/ ) (8 824 / )
ml
U ml mmol L
? = ×× × ?
抑制羟自由基能力 对照OD值 测定OD值 标准品浓度 样本测试前
标准OD值 空白OD值 ． 取样量 稀释倍数
3、计算举例：
例 1：取用生理盐水 20 倍稀释后的血清 0.2ml检测抑制羟自由基能力，测得对照管吸光度
OD值为 0.785，测定管吸光度OD值为 0.464，标准管吸光度OD值为 0.443，空白管吸光
度OD值为 0.003，标准H2O2浓度为 8.824mmol/L，则计算如下：
0 785 0 464 1 8 824 20 643.75 /
(/ ) 0 443 0 003 0 2
U ml
U ml
? = × × ×= ?
抑制羟自由基能力 ． ． ． ．． ．
（二）、组织中抑制羟自由基能力的计算：
1、定义：规定每毫克组织蛋白在 37℃下反应１分钟，使反应体系中H2O2的浓度降低 1mmol/L
为一个抑制羟自由基能力单位。
2、公式：
(/ ) U mgprot (8 824 / ) mmol L
? ? ? = ×÷ ? × ? ? ? ?
抑制羟自由基 对照OD值 测定OD值 标准品浓度 待测样本蛋白浓度 取样量
能力 标准OD值 空白OD值 ． (mgprot/ml) (0.2ml)

3、计算举例：
例 1：取５％小鼠肝组织匀浆 0.1ml 用生理盐水 10 倍稀释成 0.5％肝匀浆，取 0.2ml 检
测，测得对照管 OD 为 0.785，测定管 OD 为 0.347，标准管 OD 为 0.443，空白 OD 为 0.003，
标准浓度为 8.824mmol/L，0.5%小鼠肝匀浆的蛋白为 0.486mg/ml。
0 785 0 443 8 824 (0 486 0 2) 90 37 / (/ ) 0 347 0 003 U mgprot U mgprot
? = × ÷ ×= ?
抑制羟自由基能力 ． ． ． ．．． ． ．
（三）、溶血液中抑制羟自由基能力的计算：
1、定义：规定每毫克血红蛋白在 37℃下反应１分钟，使反应体系中H2O2的浓度降低 1mmol/L
为一个抑制羟自由基能力单位。
2、公式：
1
U mgHb / (8.824 / ) mmol L ( / ) mgHb ml
? = ×× × ÷ ?
抑制羟自由基 对照OD值 测定OD值 标准品浓度 样本测试前 血红蛋白浓度
能力（ ） 标准OD值 空白OD值 取样量 稀释倍数
3、计算举例：
例 1：取抗凝红细胞 0.2ml 加冷双蒸水 0.8ml，旋涡混匀器充分混匀 1 分钟制得溶血液，
同时测定血红蛋白为 41.182mgHb/ml。取 0.01ml 溶血液加 5.99ml 双蒸水，充分混匀
后取 0.2ml 按操作表进行检测，测得对照管 OD 为 0.785，测定管 OD 为 0.615，标准管
OD 为 0.443，标准空白 OD 为 0.003，标准浓度为 8.824mmol/L，则计算结果为：
2
本试剂盒仅用于科研、实验室
0 785 0 615 1 8 824 600 41.182 248.36 /
(/ ) 0 443 0 003 0.2 U mgHb U mgHb
? = × ×× ÷ = ?
抑制羟自由基能力 ． ． ． ． ．
例 2：取抗凝红细胞 0.2ml 加冷双蒸水 0.8ml，旋涡混匀器充分混匀 1 分钟制得溶血液，
同时测定血红蛋白为 53.684mgHb/ml。取 0.01ml 溶血液加 5.99ml 双蒸水，充分混匀后
取 0.2ml 按操作表进行检测，测得对照管 OD 为 0.785，测定管 OD 为 0.304，标准管 OD
为 0.443，标准空白 OD 为 0.003，标准浓度为 8.824mmol/L，则计算结果为：
0 785 0 304 1 8 824 600 53.684 539.06 /
(/ ) 0 443 0 003 0.2 U mgHb U mgHb
? = × ×× ÷ = ?
抑制羟自由基能力 ． ． ． ． ．
（四）、产生羟自由基能力的计算：
1、定义：规定每毫升或每毫克物质或每立方厘米内 106
个细胞在本反应体系中使反应液中
H2O2的浓度增加 1mmol/L为一个产生羟自由基能力单位。
2、公式：
( )
1
(/ ) 8 824 /
OD OD ml
U ml OD OD mmol L
? = ×× × ?
产生羟自由基能力 测定 值 对照 值 标准品浓度 样本测试前
标准 值 空白 值 ． 取样量 的稀释倍数

3、计算举例：
例 1：某中药物质稀释 10 倍后取 0.2ml 检测，结果如下：标准空白管 OD 值为 0.003，标
准管 OD 值为 0.443，对照管 OD 值为 0.217，测定管 OD 值为 0.621。则计算如下：
0 621 0 217 1 8 824 10 405.10 /
(/ ) 0 443 0 003 0 2
U ml
U ml
? = × × ×= ?
产生羟自由基能力 ． ． ． ．． ．
五、注意点：
1、 必须每一只管子单独做，并且反应时间一分钟一定要准确。
2、必须严格按照操作表顺序加试剂，不可配制混合试剂。
3、检测样本溶剂或介质可为生理盐水、双蒸水、醋酸、无水乙醇，但不能为磷酸缓冲液。
4、此法检测灵敏度较高，检测血清（浆）和组织以外样本时，最好先取原液及不同浓度稀
释后的样本,例如 5 倍稀释液或 10 倍稀释液做预试。如测定管颜色太浅可将样本用其溶
剂继续稀释至颜色较深为止。我所曾检测花粉的水提液的羟自由基，将其原液稀释 150
倍后，显色较好。
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本试剂盒仅用于科研、实验室
附录Ⅰ：羟自由基最佳取样浓度及最佳取样量摸索
一、样本前处理：
1、血清（浆）：用生理盐水将血清（浆）按 1︰1、1︰4、1︰9、1︰19 等稀释成一系列不同
浓度的血清（浆），分别取不同浓度的血清（浆）0.2ml 按血清（浆）的测定操作表
进行检测。
2、组织匀浆、细胞、线粒体或细胞膜等组织：分别用生理盐水将组织匀浆液稀释成 10%、5%、
2%、1%、0.5%、0.1%等一系列不同浓度的组织匀浆，分别取不同浓度的组织匀浆 0.2ml
按组织的测定操作表进行检测。
二、操作步骤（以血浆样本为例作最佳取样浓度摸索）：
1、样本来源：正常组大鼠眼眶取全血，肝素抗凝取血浆进行测定。
2、样本稀释：用生理盐水将血浆按 1︰1、1︰4、1︰9、1︰19、1︰49、1︰99 稀释成一系列
不同浓度的血浆，分别取不同浓度的血浆 0.2ml 按血清（浆）的测定操作表进
行检测。
3、操作表：
空白管 标准管 对照管 测定管
双蒸水（ml） 0.4 0.2 0.2
0.03％H2O2标准应用液（ml） 0.2
试剂二(底物应用液)（ml） 0.2 0.2
样本*（ml） 0.2
试剂三（ml） 0.4 0.4 0.4 0.4
混匀，37℃反应１分钟（准确以秒表计时），从加完试剂三开始到一分钟结束，立即加
入显色剂终止反应，一次只能做一只管子。
显色剂（ml） ２ 2 2 ２
混匀，室温放置 20 分钟后，１cm 光径， 550nm，双蒸水调零，测各管吸光度值。
4、预试结果：
对照 0.785 空白 0.003 标准 0.443
稀释倍数 1:1 1:4 1:9 1:19 1:49 1:99
吸光度值 0.105 0.132 0.188 0.408 0.677 0.741
抑制率 86.59% 83.16% 76.01% 47.99% 13.71% 5.66%
5、结论：
100% % %
1 19 1 19 0.2ml
OD OD
OD
? = × ～ 对照 值 测定 值 从上面的数据统计可以看出，抑制率（抑制率 ）在45 55 对照 值
之间的最佳取样浓度为 ： ，即取 ： 稀释正常组大鼠血浆 进行羟自由基正式检测。

三、讨论：
100% 20% 55% OD OD
OD
? = ×
～
～
在您进行正式检测之前，需要从每组中取2 3个样本进行上面的预实验，确定最佳浓度
对照 值 测定 值 和最佳取样量；在保证抑制率（抑制率 ）在 之间的 对照 值
同时，每组之间也应该有所差异，如果您有疑问，则需要重新摸索最佳浓度和最佳取样量。