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pPICZαB毕赤酵母质粒
基本信息
启动子: TEF1,AOX1,EM7
复制子: pUC ori
终止子: AOX1 TT
质粒分类: 酵母系列,毕赤酵母表达载体
质粒标签: C-Myc, C-His
原核抗性: Zeo
筛选标记: Zeo
克隆菌株: DH5α
培养条件: 37℃,有氧 LB
表达宿主: 酵母细胞
诱导方式: 甲醇诱导
5'测序引物: AOX5:GACTGGTTCCAATTGACAAGC
3'测序引物: AOX3:GGCAAATGGCATTCTGACAT
质粒简介
pPICZαA,B和C是3.6 kb的毕赤酵母蛋白分泌表达载体。表达的重组蛋白是融合蛋白,含有一个N-端多肽,编码酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)α-因子分泌信号。载体能够在毕赤酵母中利用甲醇诱导的高水 平的表达目的蛋白,并且可以用在任何毕赤酵母中,包括X33,GS115菌株,SMD1168H,KM71H。pPICZα A,B和C系列载体包含以下内容:①5'端含有AOX1启动子的严格调控,利用甲醇诱导表达任何感兴趣的基因(Ellis等,1985; Koutz等人,1989;tschopp等人,1987A)。②α-因子分泌信号能够分泌性表达目的蛋白。③Zeocin抗性基因在大肠杆菌和毕赤酵母都能用于筛选(Baron等人,1992; Drocourt等人,1990)。④C-端含Myc和His标签,可以用于检测和纯化重组蛋白。⑤pPICZ A, B, C三种读码框使得可以将基因克隆入载体而不发生任何移码突变。
质粒图谱
扩增流程
收到产品后,请先根据产品管壁标签来判断产品形式,并在扩增前准确查找该质粒的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉(请务必转化挑单克隆重提后使用)
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min,再加入20μl 无菌水溶解质粒;
②取2μl质粒加至100μl 感受态中,冰浴30min后,42℃热激60s,不要搅动,再冰浴2min;
(从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作)
③加入500μl无抗的LB液体培养基,180rpm震荡培养45min;
④取10μl、100μl复苏液,并分别涂布至目标质粒抗性的LB平板上;
(可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布,可以比传统涂布方法获得更多转化子)
⑤将平板正向培养1h,再倒置37度培养16h。如果要求是30度则培养20h;
(如果菌落过多,请将质粒稀释后再转化。如果无菌落,请加入10μl质粒离心全涂转化)
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中,加入对应抗生素,220rpm震荡培养14h,根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌:四区划线后挑单菌落培养,酵母菌需要先液体复苏再四区划线,再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌:穿刺接种,液体培养后四区划线,再挑单菌落液体培养。
4、平板:直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒:单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
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