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T4多聚核苷酸激酶(3’磷酸酶活性缺失)
T4多聚核苷酸激酶能够催化ATP的 γ-位磷酸基团转移到寡核苷酸链(双链或单链DNA或RNA)的 5’-羟基末端以及3’-单磷酸核苷上。T4 多聚核苷酸激酶还具有3’磷酸酶活性,将3’-磷酸基团从寡核苷酸的3’磷酸末端、脱氧3’-单磷酸核苷和脱氧3’-二磷酸核苷上水解掉。该酶经修饰后,其3’磷酸酶活性缺失,但仍保留了所有激酶的活性。 | ||
组分 | ||
组分名称数量T4 Polynucleotide Kinase (10 U/μl)20 μl/200 μl10×T4 PNK Buffer1 ml/1 ml×210mM ATP100 μl/500 μl | ||
应用 | ||
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活性定义 | ||
1 单位指 37℃条件下,30 分钟内催化1nmol 酸不溶性[32P] 掺入所需要的酶量。 | ||
储存 | ||
-20℃可保存3年。 | ||
使用注意事项 | ||
(1)1× T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液:70 mM Tris-HCl pH 7.6,10 mM MgCl2,5 mM DTT,37℃ 温育。 (2)热失活:65℃ 加热 20 分钟。 (3)在放射性标记实验中,可用 1× T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液、50pmol的γ-[32P] ATP和20单位的酶37℃温育30分钟。 (4)T4多聚核苷酸激酶需要ATP才能发挥活性,但是为了适用于高活力的放射性标记反应,在随酶提供的反应缓冲液中不含ATP。因此在磷酸化修饰核酸时请单独添加终浓度0.5~1mM ATP。 (5)要提高平齐末端或5’凹陷末端的磷酸化效率,可在加入T4多聚核苷酸激酶前,先将DNA溶液于70℃加热5分钟,然后冰上冷却,并加入5%(W/V)的PEG-8000。 (6)一般来说,进行激酶反应之后是连接反应。在这种情况下,T4多聚核苷酸激酶反应在连接酶反应缓冲液中37℃ 温育30分钟即可。反应后的产物可直接进行连接,无需改变缓冲液和进行热失活。如果连接时需要保持其它DNA片段的去磷酸化状态,则需要在连接反应前热失活T4多聚核苷酸激酶。 |