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通用型RT-LAMP恒温扩增试剂盒
产品及特点 本 试 剂 盒 可 以 用 于 RT-LAMP 等 温 扩 增 , RT-LAMP 即 逆转录和Loop-Mediated Isothermal Amplification(环介导等温扩增)的结合,专门用于快速扩增 RNA。LAMP 是 2000 年才出现的一种新颖的等温核酸扩增方法。它利用 4 或 6 条模板专一的特异引物和具有链置换能力的 DNA 聚合酶,在等温条件下(63℃左右) 30-60 分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于 RT-PCR 技术,同时还不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程,不依赖任何专门的仪器设备。目前已成功应用于人类及动植物、细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的快速检测。本试剂盒即根据 LAMP 原理开发,它具有下列特点:
1. 整合了所有成分为 2×RT-LAMP Mix,不需要单个准备各成分。RT 和LAMP 一管式操作,方便快捷,减少污染。
2. 高特异性,由于同时使用 4-6 条特异引物,所以特异性比 RT-PCR 更高。
3. 高扩增效率,扩增效率可达到 10E9-10E10,比 PCR 灵敏 10 倍,好时可检测到单拷贝的 RNA 分子
4. 65℃左右恒温下完成 RT 和 LAMP 扩增,不需要贵重的热循环仪。。
5. 提供扩增对照,便于在遇到困难时分析原因。
6. 本产品足够 50 次 20uL 体系的 RT-LAMP 扩增,本产品限于科研使用。
规格及成分 成 份 编 号 塑料袋包装
2×RT-LAMP Mix 101114a 500 uL(白盖)
LAMP 阳性对照模板-引物混合物 130923a 45 uL(黄盖)
使用手册 101114sc 1 份
运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期一年。
自备试剂 RNA 模板及 LAMP 引物(4 或 6 条)
使用方法
1. 配制自备的5×LAMP引物混合液。先加超纯水将自备的下列6种(或4种)引物干粉稀释到母液浓度(见下表),然后在一新的离心管中按表中所列体积加入各种引物和超纯水,后得到1mL的5×LAMP引物混合液。如果需要配制的5×LAMP引物混合液体积大于或小于1mL,则各成分的用量请按比例调整。此混合液可以在-20℃放置2年。1mL的5×LAMP引物混合液足够250次20uL体积的LAMP或
RT-LAMP扩增。引物名称 母液浓度 加入母液量 在 5×LAMP 引物
混合液中的浓度
自备 FIP 引物 100 uM 80 uL 8 uM
自备 BIP 引物 100 uM 80 uL 8 uM
自备 F3 引物 100 uM 10 uL 1 uM
自备 B3 引物 100 uM 10 uL 1 uM
自备 Loop F 100 uM 20 uL 2 uM
自备 Loop B 100 uM 20 uL 2 uM
超纯水 780 uL
合计 1000uL
2. 在冰上融化各组份后轻柔混匀,按下表在PCR反应管中设置反应,如果有N个样品,则需要设置N+2个反应,多的两个一个是阳性对照,一个是阴性对照:
成份 N 个样品管 阴性对照管 阳性对照管
2×RT-LAMP Mix 各 10 uL 10 uL 10 uL
自备 5×LAMP 引物混合液 各 4 uL 4 uL
自备 RNA 模板 各 1-100ng -
LAMP 阳性对照模板-引物
混合物
- - 4.5
补自备超纯水到 20 uL 20 uL 20 uL
注:如果在此步少加1 uL水,然后加入自备的可视化染料(本公司有相关产品,
编号为130833,可到www.tiandz.com了解),则反应后可直接肉眼判断
LAMP扩增是否成功。
3. 混匀,置于63℃保温60分钟。注意:如果不使用Loop引物,则好保温120分钟;如果使用Loop引物,则好保温60分钟。
4. 80℃10分钟灭活Bst DNA聚合酶。BstDNA聚合酶有外切酶活性,所以必须灭活,否则它可能会逐渐降解DNA扩增产物。
5. 产物置于-20℃备用或立即用于下游检测。扩增产物可选下列方法之一检测:
1) 如果已经加入LAMP可见光染料,则直接肉眼观察。判断标准见上。
2) 琼脂糖凝胶电泳:取LAMP扩增产物5uL在1-2%的琼脂糖凝胶上进行电泳,如果有扩增将可见LAMP特征性梯状电泳图谱;
3) 向扩增产物中直接加入本公司PCR级绿如蓝染料(产品编号70909,另售)1 uL,混匀,稍离心。如果颜色同阴性对照呈现淡黄色,则无扩增。如果同阳性对照呈现淡绿色,表示有LAMP扩增。也可在加入PCR级绿如蓝染料后将反应管在300nm的紫外线下观察,如果颜色同阴性对照呈现弱荧光,则无扩增。如果同阳性对照呈现强荧光,表示有LAMP扩增。
6. 结果分析:
1) 如果阳性对照有扩增,阴性对照没有扩增,则样品数据才有效,否则实验失败,不需要分析数据。
2) 如果阳性对照没有扩增,说明试剂盒有问题,请速跟厂家联系。
3) 如果阴性对照有扩增,说明有污染(过去的扩增产物污染了阴性样品),必须重新设计新的针对不同靶位点的LAMP引物,并且严格注意操作的规范性。