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可视化LAMP直接扩增试剂盒
产品及特点 本试剂盒是本公司通用型 LAMP 试剂盒的基础上开发的免 DNA 提取可视化LAMP 试剂盒,它有下列特点:
1. 不需要专门提取 DNA,直接用细胞裂解将液进行 LAMP,极大缩短了实验。
2. 适用于病毒、细菌、真菌、植物、动物的各种形式的样品,包括实体组织、液体样品。
3. 使用 2×可视化 LAMP MagicMix,可视化肉眼检测实验结果。
4. 使用改良的 WarmStart Bst DNA 聚合酶,反应特异性更强。
5. 高扩增效率更高,扩增效率可达到 10E9-10E10,比 PCR 灵敏一个数量级,可检测到单拷贝的 DNA 分子。
6. 本试剂盒足够 50 次 20uL 体系的免 DNA 提取 LAMP 扩增。
7. 本产品只能用于科研目的。
规格及成分 成 份 编 号 十孔盒包装
免 DNA 提取溶液 A 成分一 130985a1 100 uL
免 DNA 提取溶液 A 成分二 130985a2 200 uL
免 DNA 提取溶液 B 130985b 1 mL
2×可视化 LAMP MagicMix 180601a 500 uL
LAMP 阳性对照模板-引物混合物 180601b 50 uL
超纯水 100935 1 mL
使用手册 180601sc 1 份
运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期一年。
自备试剂 LAMP 样品及 LAMP 引物
使用方法
1. 配制免 DNA 提取溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液(足够 10 个样品)为例:在一干净塑料管中加入 10uL 溶液 A 成分一,20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超纯水,充分混合均匀即得 1mL 溶液 A 工作液。一次检测一个样品需要 100uL 溶液 A 工作液,1mL 工作液足够 10 个样品。没用完的工作液可室温放置,但最好在一周内用完,不要长期放置。如果待测样品数量为其他数字,配制的溶液 A 工作液的体积需要做相应的调整。
2. 根据材料不同参考下表取少量样品到一干净的塑料离心管中。
样品种类 取用量
动物组织 1-5 mg
鼠尾 2mm 长
血液样品 不超过 20 uL
植物叶片 1-5 mg
植物种子(去皮) 1-5 mg
酵母培养物 0.2-0.5mL 培养物沉淀
细菌培养物 0.2-0.5mL 培养物沉淀
注意:未列出样品,用户需要自己摸索最佳用量。对富含多醌多酚的植物材料(如
棉花),组织使用量最好不要超过 0.5mg。
3. 加入 100 uL 溶液 A 工作液,确保样品被溶液淹埋。
4. 95℃保温 10 分钟。
5. 待冷却到常温后加入 10uL 溶液 B 并混匀得细胞裂解液,放冰上待用。如果暂时不用,可以放-20℃长期保存。
6. 配制自备的 5×LAMP 引物混合液。
先加超纯水(不要用 TE)将各引物干粉稀释到母液浓度,然后在一新的离心管中按表中所列体积加入各种引物和超纯水,最后得到1mL的5×LAMP引物混合液。如果需要配制的 5×LAMP 引物混合液体积大于或小于 1mL,则各成分的用量请按比例调整。此混合液可以在-20℃放置 2 年。引物名称 母液浓度 加入量 在混合液中浓度
FIP 引物 100 uM 80 uL 8 uM
BIP 引物 100 uM 80 uL 8 uM
F3 引物 100 uM 10 uL 1 uM
B3 引物 100 uM 10 uL 1 uM
Loop F 100 uM 20 uL 2 uM
Loop B 100 uM 20 uL 2 uM
超纯水 780 uL
7. 在新的塑料管中设置 LAMP 反应(以一个样品为例):成份 样品管 阳性对照 阴性对照2×可视化 LAMP Mix 10 uL 10 uL 10 uL自备 5×LAMP 引物混合液 4 uL - 4 uL细胞裂解液 1-2 uL - -
LAMP 阳性对照模板-引物混合物 - 4 uL -
补超纯水到 20 uL 20 uL 20 uL
8. 混匀,此时反应液呈现淡紫色。置于 60-65℃保温 60-120 分钟(具体温度根据 LAMP 引物的 Tm 值决定)。如果是在 PCR 仪中保温,必须加热盖。如果用金属浴保温,没有热盖,建议覆盖 50uL 石蜡油,否则保温期反应体系的水分会蒸发,影响反应效率。
9. 80℃10 分钟灭活 Bst DNA 聚合酶。
10. 如果有阳性扩增,则反应液将变成淡蓝色,如果没有阳性扩增,反应液将还是淡紫色。标准的反应结果如下图(左边 6 个为阳性,右边 2 个为阴性):
11. 电泳确认:取扩增产物 5 uL 直接在 2%的琼脂糖凝胶电泳(不需要再加上样液),可见 LAMP 特征性电泳图谱。电泳需要打开反应管的盖子,释放出的气溶胶非常容易污染实验环境,为下次扩增带来假阳性,所以一定要在隔离的地方进行电泳分析。
12. 结果分析:如果阳性对照能够扩增而阴性对照不能扩出,则实验有效。如果阳性对照没有扩增出条带,则试剂盒的问题,请跟厂家联系。如果阴性对照有扩增出条带,则说明 LAMP 样品或试剂有扩增产物的污染,需要注意操作的规范性,最好重新设计引物扩增新的靶片段。