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志贺氏菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
志贺氏菌核酸检测试剂盒(一管式 PCR-荧光探针法)
◆ 产品说明
致病菌检测系列可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增,仪器实时监测扩
增过程中的荧光信号变化,自动判读结果。本产品用于志贺氏菌的检测。检出限为 10
3 CFU/ml。
◆ 产品组成(96 测试)
试剂 含量
A-Shi-P 20μL × 8 管× 12 排
NG-P 100μl× 3 支
PG-Shi-P 100μl× 2 支
◆ 适用仪器
ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600 等实时荧光 PCR 仪。
◆ 自备耗材和仪器
①冰盒;②移液器(0.5-10μL,10-100μL,100-1000μL)及配套灭菌吸头;③离心机;④涡旋混匀器;⑤金属
浴;⑥均质机、搅拌机或研钵等研磨器具;⑦电子天平。
◆ 注意事项
1.本试剂检测灵敏度高。为了防止污染,实验要分区操作。
1)一区:样本制备区。
2)第二区:模板添加区。
3)第三区:扩增及产物分析区。
★ 分区之间好进行物理性隔离,避免人为因素造成的污染。
2.实验过程中穿戴工作服和乳胶手套,不同区域独立使用工具,需更换手套和实验服。
3.严格按照操作步骤操作,试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4.反应液中的成分对光敏感,应避光保存。试剂使用前要完全解冻,但应避免反复冻融,推荐使用前离心 30
秒,并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5.反应结束后,扩增管请置于密封袋内丢弃,当日清理,开盖易造成气溶胶污染,禁止开盖。
6.不同批号试剂请勿混合使用,在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照《GB 4789.5-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》中的 5.1 处理样品,对样品进行
前增菌,制备的菌液保存待用。
以无菌操作取检样 25 g(ml),加入装有灭菌 225 ml 志贺氏菌增菌肉汤的均质杯,用旋转刀片式均质器以 8000
rpm/min~10000 rpm/min 均质;或加入装有 225 ml 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中,用拍击式均质器连续均质 1 min~
2 min,液体样品振荡混匀即可。于 41.5 ℃±1℃,厌氧培养 16 h~20 h。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
◆ 实验操作
1. 模板制备(样本制备区)
请于-20℃条件下保存,有效期 12 个月
SM-011042M-A02
2
建议使用试剂配套细菌组 DNA 提取系列产品,具体过程详见产品说明书。
2.添加模板(样本制备区,放置于冰盒中进行)
剪下所需测试数的已含有反应液的 PCR 管,放置在室温待解冻后,离心 30 秒后揭开封口膜,向每管反应液
中分别加入 5μL 模板,顺序为 NG、待测样品模板、PG-Shi-P。盖好配套的 PCR 管盖后,涡旋混匀 30s,离心 1min,
立即进行 PCR 扩增反应。
3. 扩增反应(扩增及产物分析区)
使用荧光定量 PCR 仪,荧光基团选择 FAM,淬灭基团选择 TAMRA。
按下列条件设置扩增反应:
PCR 循环 荧光收集位点
95℃ 3 分钟 1 个循环 —
94℃ 5 秒
40 个循环
—
60℃ 40 秒 ※
4.基线和阈值设定
基线调整取 3-15 个循环的荧光信号,阈值线应超过阴性对照扩增曲线的高点。
◆ 结果判定
检测样品无 Ct 值或≥40.0,曲线为直线或轻微斜线,无“S”型扩增曲线,可报告样品阴性,不含有志贺氏菌或
含量低于检测限;
检测样品 Ct≤35.0,曲线呈“S”型扩增曲线,可直接报告样品阳性,含有志贺氏菌;
检测样品 35.0<Ct<40.0,需进行一次重复实验,若 Ct 值≥40.0 则为阴性,否则为阳性。
★ NG 反应为平滑直线,PG 反应为“S”型扩增曲线且 Ct 值<30,此次检测结果有效,否则无效。如重复检测结果仍为无效,请
与技术支持人员联系。