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霍乱弧菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
霍乱弧菌核酸检测试剂盒(一管式 PCR-荧光探针法)
◆ 产品说明
致病菌检测系列可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增,仪器实时监测扩
增过程中的荧光信号变化,自动判读结果。本产品用于霍乱弧菌的检测。检出限为 10
3 CFU/ml。
◆ 产品组成(96 测试)
试剂 含量
A-VC-P 20μL × 8 管× 12 排
NG-P 100μl× 3 支
PG-VC-P 100μl× 2 支
◆ 适用仪器
ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600 等实时荧光 PCR 仪。
◆ 自备耗材和仪器
①冰盒;②移液器(0.5-10μL,10-100μL,100-1000μL)及配套灭菌吸头;③离心机;④涡旋混匀器;⑤金属
浴;⑥均质机、搅拌机或研钵等研磨器具;⑦电子天平。
◆ 注意事项
1.本试剂检测灵敏度高。为了防止污染,实验要分区操作。
1)一区:样本制备区。
2)第二区:模板添加区。
3)第三区:扩增及产物分析区。
★ 分区之间好进行物理性隔离,避免人为因素造成的污染。
2.实验过程中穿戴工作服和乳胶手套,不同区域独立使用工具,需更换手套和实验服。
3.严格按照操作步骤操作,试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4.反应液中的成分对光敏感,应避光保存。试剂使用前要完全解冻,但应避免反复冻融,推荐使用前离心 30
秒,并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5.反应结束后,扩增管请置于密封袋内丢弃,当日清理,开盖易造成气溶胶污染,禁止开盖。
6.不同批号试剂请勿混合使用,在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照《SN/T 1022-2010 进出口食品中霍乱弧菌检验方法》中的 7.1 和 7.2 处理样品,对样品进行前增菌,制备
的菌液保存待用。
以无菌操作取检样 25 g,放入装有 225 mL 灭菌 APW 增菌液的均质杯内,于 8000rpm/min~10000rpm/min 均质
1 min~2 min,或以剪刀充分剪碎,制成 1:10 样本匀液。深冻样品、干品、盐渍产品的初始增菌液放置在 37℃ ± 1℃
培养 6 h ± 1 h,新鲜样品的初始增菌液放置在 41.5 ℃ ± 1 ℃培养 6 h ± 1 h。如果样品不够 25g,则取全部样品,加
入 9xmL 增菌液以获得 10-1 浓度的样品匀液。若上述制备的待检样品不能在当日进行培养,应放置在 2℃~8℃保存
至次日。为提高检出率,可进行第二次增菌,取 1 ml 培养物接种到 10 ml 的 APW 中,置于 41.5 ℃ ± 1 ℃培养 18 h
± 1 h(加入样品前,APW 应预先保温至 37℃±1℃)。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
请于-20℃条件下保存,有效期 12 个月
SM-011082M-A02
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◆ 实验操作
1. 模板制备(样本制备区)
建议使用试剂配套细菌组 DNA 提取系列产品,具体过程详见产品说明书。
2.添加模板(样本制备区,放置于冰盒中进行)
剪下所需测试数的已含有反应液的 PCR 管,放置在室温待解冻后,离心 30 秒后揭开封口膜,向每管反应液
中分别加入 5μL 模板,顺序为 NG、待测样品模板、PG-VC-P。盖好配套的 PCR 管盖后,涡旋混匀 30s,离心 1min,
立即进行 PCR 扩增反应。
3. 扩增反应(扩增及产物分析区)
使用荧光定量 PCR 仪,荧光基团选择 FAM,淬灭基团选择 TAMRA。
按下列条件设置扩增反应:
PCR 循环 荧光收集位点
95℃ 3 分钟 1 个循环 —
94℃ 5 秒
40 个循环
—
60℃ 40 秒 ※
4.基线和阈值设定
基线调整取 3-15 个循环的荧光信号,阈值线应超过阴性对照扩增曲线的高点。
◆ 结果判定
检测样品无 Ct 值或≥40.0,曲线为直线或轻微斜线,无“S”型扩增曲线,可报告样品阴性,不含有霍乱弧菌或
含量低于检测限;
检测样品 Ct≤35.0,曲线呈“S”型扩增曲线,可直接报告样品阳性,含有霍乱弧菌;
检测样品 35.0<Ct<40.0,需进行一次重复实验,若 Ct 值≥40.0 则为阴性,否则为阳性。
★ NG 反应为平滑直线,PG 反应为“S”型扩增曲线且 Ct 值<30,此次检测结果有效,否则无效。如重复检测结果仍为无效,请
与技术支持人员联系。