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拟态弧菌核酸检测试剂盒(恒温荧光法)
拟态弧菌核酸检测试剂盒(一管式恒温荧光法)
◆ 产品说明
动物疫病检测系列基于独特的恒温荧光检测技术,可针对食品、动物组织等样品中病原的特异核酸
片段进行扩增,通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于拟态弧菌的检测,检出限为 104copies/μl 基因组 DNA。
◆ 产品组成(48 测试)
012041MⅢ
试剂 含量
A-VM-I 22μL× 48 管
B-I 90μL × 1 支
PG-VM-I 50μL × 1 支
◆ 适用仪器
Dhelix-C、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308C 等恒温荧光检测仪,ABI 7500,LightCycler480,CFX 96 等
荧光 PCR 仪。
◆ 自备耗材和仪器
①灭菌 1.5mL 或 2.0mL 离心管;②冰盒;③移液器(0.1-2.5μL,0.5-10μL,10-100μL,100-1000μL)及配套灭
菌吸头;④离心机;⑤涡旋混匀器;⑥金属浴
◆ 注意事项
1.本试剂检测灵敏度高。为了防止污染,实验要分区操作。
1)一区:样本制备区。
2)第二区:模板添加区。
3)第三区:扩增及产物分析区。
★分区之间好进行物理性隔离,避免人为因素造成的污染。
2.实验过程中穿戴工作服和乳胶手套,不同区域独立使用工具,需更换手套和实验服。
3.严格按照操作步骤操作,试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4.反应液中的成分对光敏感,应避光保存。试剂使用前要完全解冻,但应避免反复冻融,推荐使用前离心 30
秒。
5.反应结束后,扩增管请置于密封袋内丢弃,当日清理,开盖易造成气溶胶污染,禁止开盖。
6.不同批号试剂请勿混合使用,在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照下述方法处理样品。
(1)若对样本不增菌直接进行检测,则取患病动物的病灶组织做匀浆备用。
(2)若对样本中细菌进行增菌检测,则包括一次增菌和第二次增菌,一次增菌的操作步骤为:在无菌条件下,
取充分剪碎的样品,加入盛有 9 倍量的 3%的 NaCl 碱性蛋白胨水的灭菌容器内,在 37±3℃条件下培养 4h~15h,
所述的第二次增菌,其操作步骤为:吸取一定量一次增菌的增菌液加入盛有 9 倍量的 3%NaCl 碱性蛋白胨水
(APW)的灭菌试管内, 在 37℃±3℃条件下培养 4h~15h。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
◆ 实验操作
1. 模板制备(样本制备区)
请于-20℃条件下保存,有效期 12 个月
SM-012041MⅢ-B02
2
请参照水生动物病害基因组 DNA 快速提取试剂盒说明书的提取步骤。
2.添加模板(模板添加区,放置于冰盒中进行)
取出所需测试数的已含有反应液 A-VM-I 的 PCR 管,将试剂完全解冻,离心 30 秒,在管盖上标记管名(阴性
对照管 NG、样品 XX、阳性对照管 PG)。打开管盖向各管管底分别加入 1μL B-I,盖上阴性对照管管盖,其他各管
分别沿管壁加入 2μL 模板,顺序为待测样品模板、PG-VM-I,依次盖好各管管盖,离心 30 秒,立即进行扩增反应。
3. 扩增反应(扩增及产物分析区)
①恒温仪器 63℃条件下反应 90 min。待仪器升温至 63℃后,新建程序,设置实验名称及反应时间,将步骤 2 中
离心后的 PCR 反应管放入恒温荧光分子检测仪,点击开始检测。
②若使用荧光定量 PCR 仪,则荧光基团选择 FAM,淬灭基团选择 None,将 63℃ 15 s,63℃ 45 s 作为一个
循环,于 63℃ 45 s 处收集荧光信号,90 个循环。
若使用其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
◆ 结果判定
①恒温仪器自动判定结果,若显示“阳性”,则样品中含有拟态弧菌;若显示“阴性”,且没有出现 S 型扩增曲线,
则样品中不含有拟态弧菌或含量低于检测限。
②在荧光定量 PCR 仪上,根据有无“S”型扩增曲线判定结果。若有“S”型扩增曲线,则样品中含有拟态弧菌;若
无“S”型扩增曲线,则样品中不含有拟态弧菌或含量低于检测限。
★ NG 反应管结果显示“阴性”,PG 反应管结果显示“阳性”,此次检测结果有效,否则无效。如重复检测结果
仍为无效,请与技术支持人员联系。