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获取电话pKD46大肠敲除质粒
基本信息
启动子: araBAD promoter
复制子: pSC101 ori
终止子: λ tL3 terminator
原核抗性: 氨苄青霉素Amp
克隆菌株: 大肠杆菌DH5α
培养条件: LB培养基，30℃
表达宿主: 大肠杆菌
诱导方式: 阿拉伯糖
质粒简介
pKD46质粒是目前应用最广泛的Red同源重组质粒，该质粒含有受阿拉伯糖启动子调控的exo、bet、gam基因，其复制子为低拷贝温敏型复制子，便于质粒的消除。
与同源重组基因敲除相关的3个酶：
1、Exo蛋白：Exo蛋白是一种核酸外切酶，单亚基的分子量为24 kD，Exo蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子，中间有一中空的通道，通道的一端可容纳双链DNA分子，另一端只可容纳单链DNA。Exo蛋白可结合在双链DNA的末端，从DNA双链的5’端向3’端降解DNA，使DNA分子形成3’粘性末端。
2、Beta蛋白：Beta蛋白在Red同源重组中起着决定性作用，具有介导互补单链DNA退火的功能，是一种退火蛋白，单亚基的分子量为25.8 kD。在溶液中，Beta蛋白自发地形成环状结构，紧紧地结合在单链DNA的3’突出端，防止DNA被单链核酸酶降解，并介导互补单链DNA的退火。双链DNA退火完成后，Beta蛋白从DNA双链上解离下来。
3、Gam蛋白：Gam蛋白为16kD的多肽分子，可与RecBCD核酸外切酶结合，抑制其对外源DNA的降解作用，防止外源DNA 进入细胞后被宿主降解。
质粒图谱
pKD46大肠敲除质粒使用说明：
1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl无菌水溶解质粒，室温放置1min；
2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；
3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；
4、42℃热激90s，再冰浴2min；
5、加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；
6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清混匀菌体沉淀；
7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；
8、将平板正向培养1h，再倒置培养12h~16h；
9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12h~16h，根据实验需要提取质粒。
pKD46大肠敲除质粒注意事项：
1、如果您收到的是甘油菌种，请先四区划线，挑取单克隆培养。
2、如果第二天转化平板长的过多，请将质粒按比例稀释后再转化。
