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pCP-Cre大肠敲除质粒
基本信息
原核抗性: 氯霉素Chl
克隆菌株: 大肠杆菌DH5α
培养条件: 30℃
质粒简介
市面上没有见到可进行原核表达Cre酶的温敏质粒(温敏即意味着可以和pKD46一样进行质粒消除)。此质粒由pCP20改造而成,包含其Ori和Cm抗性基因。Cre基因由弱化的LacUV5启动子控制,于1mM ITPG诱导下过夜即可消除基因组中的抗性基因。(试管中长到OD600=0.6-0.8开始诱导,过夜后LB平板划线,挑单菌落验证抗性丢失)此质粒为低拷贝质粒,用试剂盒提质粒时,10ml菌液提质粒,过1个柱子,用50ul水收集,可以看到条带。普通通量的提质粒不易看到条带。
质粒图谱
pCP-Cre大肠敲除质粒使用说明:
1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min,再加入20μl无菌水溶解质粒,室温放置1min;
2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态,置于冰盒上解冻,并做好标记;
3、取2μl质粒加至100μl感受态中,冰浴30min;
4、42℃热激90s,再冰浴2min;
5、加入900μl无抗的LB液体培养基,180rpm震荡培养45min;
6、6000rpm离心5min,仅留100ul上清混匀菌体沉淀;
7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上,倒入适量玻璃珠,涂匀液体;
8、将平板正向培养1h,再倒置培养12h~16h;
9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中,震荡培养12h~16h,根据实验需要提取质粒。
pCP-Cre大肠敲除质粒注意事项:
1、如果您收到的是甘油菌种,请先四区划线,挑取单克隆培养。
2、如果第二天转化平板长的过多,请将质粒按比例稀释后再转化。