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农杆菌LBA4404菌种
英文名称:Agrobacterium LBA4404 Strain
运输:低温
保存:-80度
有效期:3年
货期:现货
其他:
产品介绍:
农杆菌 LBA4404 菌株为 Ach5 型背景,核基因中含有筛选标签—利福平
抗性基因 rif。为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的章鱼碱型
Ti 质粒 pAL4404,此质粒含有 vir 基因(vir 基因是 T-DNA 插入植物基因组
必需的元件,pAL4404 质粒自身的 T-DNA 转移功能被破坏,但可以帮助转入
的双元载体 T-DNA 顺利转移)。pAL4404 型 Ti 质粒含有筛选标签:strep,赋
予 LBA4404 菌株链霉素抗性。此菌种多用于烟草转化,却很少用于拟南芥,
其自发突变获得四环素抗性得几率很低。
运输及保存 低温运输,-80℃保存,有效期一年。
自备试剂 YPD 培养基、山梨醇、超纯水等
使用方法
质粒转化农杆菌LBA4404菌种的方法有很多,如电转化、化学转化等。根据实验方法的不同,用的试剂和培养基有所不同。本手册提供一个电转化方
法。
1. 挑取酵母单菌落,接种至含有 5 mL YPD 培养基的 50 mL 三角瓶中,
30℃,250-300 r/min 培养过夜;
2. 取 100-500 μL (≤1:100)的培养物接种至含有 50 mL 新鲜培养基的
200 mL 三角摇瓶中,28~30℃,250-300 r/min 培养过夜(约 20 小时),
至 OD600 达到 1.3~1.5;
3. 将细胞培养物于 4℃,1500g 离心 5 分钟,用 50 mL 的冰预冷的无菌水
将菌体沉淀重悬;
4. 按步骤 3 离心,用 25 mL 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;
5. 按步骤 3 离心,用 2-5 mL,1M 的冰预冷的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬;
6. 按步骤 3 离心,用 160 μL 的冰预冷的 1M 的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬,
其终体积约为 240 uL;
7. 将 5~20 μg 的线性化 DNA 溶解在 5~10 μL TE 溶液中,与 80 μL 的上
述步骤 6 所得的菌体混匀,转至 0.2 cm 冰预冷的电转化杯中;
8. 将电转化杯冰浴 5 分钟;
9. 根据电转化仪提供的资料,参考其他文献及多次摸索,确定合适的电压、
电流、电容等参数,按优化的参数,进行电击(推荐:电压 1.5 kV ;电
容 25 μF ;电阻 200 Ω;电击时间为 4 ~10 msec)。
10. 电击完毕后,马上加入 1 mL 1M 的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀,转
至 1.5 mL 的 EP 管中,置于 30℃摇床低速培养 1 小时;
11. 将菌体悬液涂布于 MD 平板上,每 200~600 μL 涂布一块平板;
12. 将平板置于 30℃倒置培养,直至单个菌落出现(3-4 天)。