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获取电话一站式His标记蛋白质微量纯化套装
英文名称：One-Stop His-Tagged Protein Miniprep Pack
运输：低温
保存：负20℃
有效期：1年
货期：1-2天
其他：
产品介绍：
微量纯化His标记蛋白质
产品及特点
基于 His-Ni 亲和层析的蛋白质纯化方法是目前分离纯化重组表达蛋白质的
重要方法，本产品就是专门用于上述实验的一站式产品，具有下列特点：
1. 一站式套装，含所需的介质、溶液和层析柱，用户只需要提供表达 His 蛋白
的细菌（酵母、杆状病毒、培养细胞）即可，非常方便。
2. 专一性强，一次过柱即可获得纯度高达 95%的 His-标记蛋白。
3. 变性和非变性条件均可使用，也适用于纯化包涵体中的 His 标记蛋白。
4. 每次可以处理 20 mL 的表达菌液，适合初步筛选和鉴定。
5. 提供 4 mL 浓度为 50%的 Ni-Agarose 介质，其最大载量为 20-30 mg His
标记蛋白质/mL 介质。
6. 介质为 CL-6B 琼脂糖，含四个 Ni 离子螯合基团，比只有四个 Ni 离子螯合
基团的 Ni-IDA 更有效。
7. 本介质可以反复使用多次。
运输及保存 常温运输和保存，但介质长期需 4℃保存，溶菌酶、Benzonase 溶液和 PMSF
溶液需-20℃保存，有效期一年
自备试剂 去离子水、20%乙醇、针头过滤器（0.45 μm）
使用方法 1. 将 Ni-Agarose 介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中
（介质用量需要根据 His 蛋白产量决定，其最大载量为 20-30 mg His 标记
蛋白质/mL 介质，请根据实验需要取适量的 Ni-Agarose 介质加入层析柱）。
2. 用 5 倍柱体积（指填料的体积，下同）自备去离子水洗柱，共三次。
3. 用 5 倍柱体积的新配结合液洗柱（配方如下，以 10 mL 为例），共三次：
成分 用量 在结合缓冲液中的浓度
1 M Tri-HCl（pH7.9） 0.2 mL 20 mM
1 M 咪唑溶液 0.1 mL 10 mM
5 M NaCl 溶液 1 mL 500 mM
自备去离子水 8.7 mL -
4. 室温 5000 g 离心 10 分钟收集 20 mL 表达菌液，弃上清，沉淀（约 100 mg）
放冰上待用或放-80℃保存。最好用不加诱导物的菌液做对照样。
5. 如果超声破碎细菌：加入 1 mL 冰浴的结合液（1 mL 菌液需要用 50 uL 结
合液），再加入 25 uL PMSF（10 mg/mL）溶液，冰上超声裂解菌体直到
在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但
裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。如果酶法裂解细菌：加入 1 mL 冰
浴的含溶菌酶的结合液（先取 20 mL 结合液，加入所有 30 mg 溶菌酶干粉，
溶解后分装成 1 mL/管，剩余的-20℃放置），再加入 25 uL PMSF（10
mg/mL）溶液和 1 uL Benzonase，冰上放置 30 分钟。
6. 4℃下 13000-15000 g 离心 10 分钟，去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，
收集上清，留样做 SDS-PAGE 电泳对照。如果要纯化裂解液中可溶部分的
His 标记蛋白，则直接进入第 7 步；如果要纯化裂解液中包涵体（沉淀部分）
中的 His 标记蛋白，则直接进入第 12 步。
A、纯化细胞裂解液中可溶部分的 His 标记蛋白
7. 将上步得到的上清液上柱，让重力使裂解液自然流出。如要提高 His 标记蛋
白与介质的结合效率，可用试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让
细菌裂解液和介质在 4℃结合 30 分钟或过夜。
8. 用 10 倍柱体积结合液洗柱（配方见上表），收集并保存穿透液（含杂质或没
被吸附的 His 标记蛋白，可做 SDS-PAGE 电泳的对照）。
9. 如果用一步式洗脱法（适合已经找到最佳咪唑浓度的情况），则直接用适量
的新鲜配制的洗脱液洗柱，收集并保存穿透液（含 His 标记蛋白）。洗脱液
的配方如下（以 1 mL 体积和最佳咪唑浓度是 500 mM 为例）：
成分 用量 在洗脱液中的浓度
1 M Tri-HCl （pH7.9） 20 uL 20 mM
1 M 咪唑溶液 500 uL 500 mM
5 M NaCl 溶液 100 uL 500 mM
自备去离子水 380 uL -
10.如果用多步式洗脱（适合不知道最佳咪唑浓度或一步式洗脱杂质多的情况），
则按上表配制一系列咪唑浓度不同（如 40、60、100、200、300 和 500
mM），其他成分浓度不变的洗液，按从低到高的顺序洗涤并收集样品，
SDS-PAGE 电泳检测 His 标记蛋白所在的区域。
11.洗脱后，依次使用10 倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用 3倍柱体积的20%
乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），最后堵住层析柱下端的漏口，4℃保存待下
次使用。
B、纯化包涵体中 His 标记蛋白
12.将第 6 步离心得到的包涵体沉淀重悬于 1-3 mL 含盐酸胍结合液中或 1-3
mL 含尿素结合液中（建议优先使用尿素做变性剂，因为得到的洗脱液可以
直接跑 SDS-PAGE，而用盐酸胍的洗脱液需先除盐后才能电泳）。冰浴 1 小
时以使包涵体溶解，期间可轻柔摇晃几次。含变性剂的结合液配方如下（以
10 mL 为例）：
成分 含盐酸胍结合液 含尿素结合液
1M Tri-HCl（pH 7.9） 200 uL 200 uL
5M NaCl 溶液 1 mL 1 mL
盐酸胍（MW=95.6） 5.7 g 无
尿素（MW=60.1） 无 4.8 g
自备去离子水 加水到 10 mL 加水到 10 mL
13.室温 10000×g 离心 20 分钟，沉淀为未溶解的包涵体。将上清（含溶解后
的 His 标记蛋白）以自备的针头过滤器（0.45 μm）过滤。
14.将滤过液上柱，后续纯化步骤同第 7-第 11 步。只是所用结合液和洗脱液均
含变性剂，含变性剂的洗脱液配方见下表（以 1 mL 为例）：
成分 含盐酸胍洗脱液 含尿素洗脱液
1M Tri-HCl（pH7.9） 20 uL 20 uL
1M 咪唑溶液 500 uL 500 uL
5M NaCl 溶液 100 uL 100 uL
盐酸胍（MW=95.6） 0.57 g 无
尿素（MW=60.1） 无 0.48 g
自备去离子水 补水到 1 mL 补水到 1 mL
注意事项 整个实验需避免含巯基乙醇、DTT 和 EDTA 等成分。若洗脱液不能将 His 标记蛋白洗脱下来，可改用 pH 6.5- 4.5 的 pH 递减的 Tris-HCl 洗脱
