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获取电话莱氏无胆甾原体染料法荧光定量PCR试剂盒
产品及特点
1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。
2. 根据莱氏无胆甾原体保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染。
5. 本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。
本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。
规格及成分
成分 | 编号 | 十孔盒包装 |
2×qPCR MagicMix | 90408 | 500μL（棕色管） |
荧光PCR专用模板稀释液 | 180701 | 1 mL（黄盖） |
莱氏无胆甾原体PCR引物混合物 | 14-37080 | 100μL（白盖） |
莱氏无胆甾原体PCR阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) | 14-37080 | 50μL（红盖） |
使用手册 | 14-37080 | 1份 |
运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限一年。
自备试剂
DNA模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。
使用方法
一、稀释PCR阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
8. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号（浓度为1×10E4 拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5 拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。
9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。
三、设置qPCR反应（20 μL体系，在样品制备室进行）
10. 如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）：
成分 | 样品管 N+2个 | PCR阴性对照管 | PCR阳性 对照管（2-7管） |
2×qPCR MagicMix （棕色管） | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
莱氏无胆甾原体PCR 引物混合液（白盖） | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
自备10×ROX (见注) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
N+2待测样品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
第7步所得PCR阳性对照 稀释液（2-7号） | 不加 | 不加 | 各6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…） |
注:仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，则用水替代。
12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 92℃ | 5分钟 |
PCR反应 （30个循环） | 92℃ | 60 秒 |
54℃ | 60 秒 | |
72℃ | 60 秒 |
13. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时，大吸收光谱在471 nm，结合DNA时的大吸收光谱在500 nm，大发射光谱在530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。
四、数据处理
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
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