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中文名称：偷死野田村病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒
英文名称：Covert Mortality Nodavirus(CMNV)
运输：低温运输
保存：-20℃保存
有效期：一年
货期：现货
产品介绍：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），是体外酶促合成特异DNA片段的一种经典方法，由变性、退火及适温延伸组成，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，是分子生物学实验的最基本实验技术。
如何选择偷死野田村病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒：RT-PCR是指将RNA 的反转录（RT）和cDNA 的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。利用逆转录酶将RNA逆转录（RT）成cDNA（Complementary DNA），再以cDNA 为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR的常见应用包括基因检测、转录物变异检测，以及克隆和测序用cDNA模板制备。
PCR反应鉴定——PCR反应条件
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 94℃ | 5 min | 1 |
变性 | 94℃ | 10 sec |
30-40 |
退火 | 50-65℃ | 20 sec | |
延伸 | 72℃ | 30 sec/kb | |
终延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
注：
a）退火温度：请参考引物的理论 Tm 值，退火温度可设置低于引物理论值 2-5℃。
b）延伸时间：需要根据片段的长度来确定，对于1 kb以内的DNA片段，建议延长时间为30 sec。
偷死野田村病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒常见问题与解决方法:
常见问题 | 可能原因 | 解决方法 |
阳性对照、待测样本均无条带。 | PCR反应体系或反应条件不合适。 | 使用梯度PCR摸索PCR反应条件。 |
PCR试剂保存不当失去活性。 | 2× PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。 | |
引物设计问题。 | 尝试重新设计引物进行检查。 | |
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。 | 不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。 | 使用新鲜的试剂。 |
加入组织裂解液过量。 | 增大反应体系，或减少裂解液的用量。 | |
样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。 | 裂解混合液液可在4℃保存2-3天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。 | |
模板加入量不适合。 | 在反应体系10-20%范围内优化模板加入量。反应效性能较差时，可以降模板浓度调节到低于10%的范围。 | |
PCR循环数不足。 | 适当增加PCR的循环数，推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂，一般PCR反应要比用纯化的 DNA模板多5-10个循环为佳。 | |
非特异性扩增 | PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。 | 增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。 |
PCR引物错配。 | 重新设计PCR引物。 | |
配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。 | PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。 | |
阴性对照出现目的条带 | 操作工具或试剂污染。 | 实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 |
样本间交叉污染。 | 每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。 |
注意事项
1. 建议使用新鲜采取的动物组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。
2. 试剂Buffer AL若低温保存，易产生沉淀。在使用前务必将其在室温中放置一段时间，也可在37℃水浴中预热10 min，以溶解沉淀，混匀后再使用。
3. 电泳检测时，切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则，电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带，影响实验结果。
4. 建议扩增片段长度1 kb以内，以便扩增效率佳。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
偷死野田村病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒运输与保存方式
冰袋运输。-20℃避光储存，有效期一年。本品避免反复冻融。建议分装保存。
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