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获取电话ATCC15834 Electro感受态细胞
ATCC15834 Electroporation-Competent Cell 产品说明书
产品规格 （CAT#: LM1100）
ATCC15834 Electro： 50μl/支
pCAMBIA2301（control vector，10ng/μl )： 10μl
保存条件(保质期)： -80℃（12个月）
ATCC15834 Electro感受态细胞基因型
Agrobacterium rhizogenes pRi15834 (agropine type)
ATCC15834 Electro感受态细胞产品说明
发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。ATCC15834发根农杆菌菌株来源于ATCC（美国模式培养物集存库/American type culture collection），为发根农杆菌原始菌株（ wild strain），含有pRi15834农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（禾本科，豆科，烟草等），特别适合对紫杉醇，青蒿等药用植物毛状根的诱导。唯地生物开发的ATCC15834电转感受态细胞经特殊工艺制作，pCAMBIA2301质粒（卡那霉素抗性）检测，转化效率>105 cfu/μg DNA。
ATCC15834 Electro感受态细胞常规操作方法
1. 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入0.01-1 μg质粒DNA（体积不大于6ul，最好用试剂盒抽提，双蒸水溶解；转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200 μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。
3. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad 推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯从冰中拿出，吸水纸吸干外表面水份，快速放入电转槽中，启动电击，电击完成快速插入冰中，加入1 ml无抗生素的TY，并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的平板上，倒置放于28℃培养箱培养72小时
●ATCC15834菌株质粒转化相关抗生素使用浓度：
抗生素 | 配方 | 筛选培养基 | 原液 | 工作液 |
硫酸卡那霉素(kan) | 双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 | YMB或TY | 100 mg/ml | 100 μg/ml |
壮观霉素 (spec) | 双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 | TY | 50 mg/ml | 70 μg/ml |
常用农杆菌抗性： (R：抗；S：敏感。)
农杆菌菌株 | 羧苄青霉素(carb) | 链霉素(strep) | 利福平(rif) | 氯霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
Ar.A4 | S | S | S | S | R |
ATCC15834 | S | S | S | S | S |
MSU440 | S | R | S | S | S |
Ar.Qual | S | R | S | R | S |
● YMB配方（1L）：
Yeast extract 1g
MgSO4·7H2O 0.2g
K2HPO4 0.5g
NaCl 0.1g
甘露醇 10g
补水到1L体积，完全溶解后，调PH值到7.0，121度、20分钟高温灭菌
若配制YMB固体培养基，则加入15g 琼脂粉。
● TY配方（1L）：
Tryptone 5g
Yeast extract 3g
补水到1L体积，完全溶解后，121度、20分钟高温灭菌
配制1M的氯化钙水溶液，121度、20分钟高温灭菌
每1L 灭菌的TY液体营养液中加入10ml 无菌的1M氯化钙水溶液即可。
若配制TY固体培养基，则加入15g 琼脂粉。
注意事项
1. ATCC15834生长缓慢，转化质粒的ATCC15834菌涂布在含抗生素的平板上应生长72小时。
2. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
3. 电转感受态细胞中不可混入气泡，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
4. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量或最终用于涂板的菌量。
同一批感受态细胞，用含目的片段的T载体质粒转化（阳性对照）能长出密密麻麻的菌落，而用另一种载体和目的片段的连接产物转化，却一个菌都没长出来，重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关，还是连接出了问题？哪个可能性大些？
答：应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照，确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。
感受态细胞放到-80冰箱了有半年了，还能用来转化质粒吗？
答：如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况，是可以用来转化的，但是由于冻存时间过长，转化效率会有所下降，如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的，如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。
