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获取电话DH10Bac感受态细胞
DH10Bac Chemically Competent Cell 产品说明书
产品规格（CAT#: LM1071）
DH10Bac： 100μl/支
pUC19 (control vector，10pg/μl): 10μl
保存条件(保质期)： -80℃（6个月）
DH10Bac感受态细胞基因型
F- mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) ?80lacZ?M15 ?lacX74 recA1 endA1 araD139 ?(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsLnupG /pMON14272 / pMON7124
DH10Bac感受态细胞产品说明
DH10Bac菌株主要用于生产重组杆状病毒分子（Bac-to-Bac杆状病毒表达系统）。该菌株中含有父本杆粒 bMON14272 、辅助质粒 pMON7124 ：父本杆粒 bMON14272包含 mini-F复制子, 卡那抗性基因, attTn7 位点和 lacZα互补因子；辅助质粒 pMON7124 含有 tnsABCD区（tnsABCD region supplies the transposition proteins required for insertion of the mini-Tn7 from the donor plasmid into its target site on the parent bacmid），具有四环素抗性，在细胞扩增过程中丢失，但可提高供体质粒pFastBac（具有庆大霉素抗性）转化后的基因转座效率。mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10Bac菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（Therefore , genomic DNA , both prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently in DH10Bac）。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。?80lacZΔM15 的存在使DH10Bac可用于蓝白斑筛选，DH10Bac感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>108cfu/μg DNA。
DH10Bac感受态细胞操作方法
供体质粒（pFastBac等）转化重组方法：
1. DH10Bac感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入供体质粒（pFastBac等）1ng，并用手拨打EP管底混匀，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入900μl不含抗生素的SOC液体培养基，37℃，225 rpm复苏4小时。
4. 复苏完成后，用SOC稀释转化液到（10-1，10-2），每个稀释用吸取100ul铺一个LB平板（共涂3个平板），平板包含50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，7ug/ml tetracycline，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱48h（抗生素含量较高，需在37度长时间培养才能挑到合适克隆）。
阳性验证：
1. 挑10个白色的克隆，重新划线在LB平板（50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，7ug/ml tetracycline，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG）。37度过夜培养。
2. 挑选白色的克隆，转接到含有50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，7ug/ml tetracycline的LB培养液中，过夜培养。
3. 使用试剂盒（QIAGEN cat. 12162）或异丙醇-醋酸钠法抽提重组质粒DNA（＞100kb）。使用PCR法分析重组质粒是否正确重组。
pUC19检测转化效率方法：
1. DH10Bac感受细胞态从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底混匀，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养液LB，37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 取100μl转化液涂布到含50-100ug/ml氨苄的LB平板上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱12-16h，统计计算转化效率。
DH10Bac感受态细胞注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 涂板时务必涂干，平板表面不留任何水份。
同一批感受态细胞，用含目的片段的T载体质粒转化（阳性对照）能长出密密麻麻的菌落，而用另一种载体和目的片段的连接产物转化，却一个菌都没长出来，重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关，还是连接出了问题？哪个可能性大些？
答：应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照，确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。
感受态细胞放到-80冰箱了有半年了，还能用来转化质粒吗？
答：如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况，是可以用来转化的，但是由于冻存时间过长，转化效率会有所下降，如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的，如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。
