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名称：质粒中量提取试剂盒
品牌：Omega
供应商：上海远慕
型号：Plasmid Midi Kit(2)
用途：从小于15ml培养过夜的菌液提取50-70ug高纯度质粒DNA
质粒中量提取试剂盒Plasmid Midi Kit(2)操作步骤：
提示：将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，使用后置于2-8℃保存。
1.取过夜培养菌40-60ml（最大不超过90 ml）菌液，装入50ml离心管中，4,500~6,000 x g于4℃离心5 min沉淀菌体（也可12,000 x g离心2分钟），完全弃除上清。
2.加入2.5 ml 溶液P1，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。室温放置3~5 min。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3.加入2.5 ml 溶液P2，轻轻颠倒离心管6~8次，室温放置5 min，使细菌完全裂解，溶液透明。 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
4.加2.5 ml溶液PⅢ，立即颠倒离心管6~8次，充分混匀，至白色絮状物产生。上述裂解液于4℃ 12,000~16,000 x g离心10~15 min，小心吸出上清，移入新的50 ml离心管中。加入溶液PⅢ后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。
注意： 使用异丙醇沉淀，蛋白杂质和盐离子共沉淀较少，可能看不到明显的较大团块沉淀，但是质粒还是可以完全沉淀下来，不影响实际的质粒产量。如果你习惯看见较大的沉淀团块操作，可以选择2倍体积的无水乙醇沉淀。
5.加入5 ml 异丙醇，颠倒离心管，充分混匀。
6.于4℃ 12,000~16,000 x g离心10 min，小心弃去上清，倒置于吸水纸上轻轻沥干残余液体，加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速离心5分钟，弃上清，晾干沉淀。
质粒中量提取试剂盒Plasmid Midi Kit(2)注意事项：
1.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、PⅢ的用量。
2.提取大质粒时操作动作要轻柔，应该使用剪大了开口的吸头，防止机械剪切对DNA的损坏。
3.DNA沉淀液沉淀离心后，可能看不到明显沉淀。如未见沉淀，担心DNA丢失，可保留上清液，待完成全部操作后电泳鉴定，以确定是否获得终产物（数百微克DNA离心沉淀在管的侧壁上，可能无法看到明显团块）。
4.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。
5.质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道确切大小。
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