大鼠高敏三碘甲状腺原氨酸(u-T3)ELISA Kit

大鼠高敏三碘甲状腺原氨酸（u-T3）ELISA快速检测试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用

产品名称： 大鼠高敏三碘甲状腺原氨酸(u-T3)ELISA Kit
英文名称： Rat Ultrasensitivity Tri-iodothyronine,u-T3 ELISA Kit
货号： CSB-E08869r
规格： 96T
种属： Rat
待测物名称： Ultrasensitivity Tri-iodothyronine,u-T3
缩写： u-T3
反应时间： 1-5h
所需样本体积： 50-100ul
检测波长： 450 nm

大鼠高敏三碘甲状腺原氨酸(u-T3)ELISA Kit

特异性：本试剂盒可检测大鼠u-T3，且与其他相关物质无交叉反应。
大鼠高敏三碘甲状腺原氨酸(u-T3)ELISA Kit

有效期：6个月
大鼠高敏三碘甲状腺原氨酸(u-T3)ELISA Kit

预期应用：ELISA法定量测定大鼠血清、血浆或其它相关生物液体中u-T3含量。
大鼠高敏三碘甲状腺原氨酸(u-T3)ELISA Kit

说明
1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
大鼠高敏三碘甲状腺原氨酸(u-T3)ELISA Kit

实验原理
本试剂盒采用酶联免疫直接竞争法检测u-T3。微孔板上包被有抗体u-T3抗体。加入u-T3标准品或样品，然后加入生物素标记的u-T3。样品中的u-T3、生物素标记u-T3与固相板上的抗u-T3抗体发生竞争结合。再向微孔中加辣根过氧化物酶标记的亲和素，形成固相抗体-生物素化u-T3-亲和素-HRP复合物。经加底物显色后，随着样品中u-T3浓度的升高，显色OD值呈逐渐下降的线性关系。
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试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板（Assay plate ）：一块（96孔）。
2. 标准品（Standard）：5×1ml/瓶。
标准品 S1 S2 S3 S4 S5
浓度
（ng/ml） 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0

3. 生物素标记u-T3：1×6ml/瓶。
4. 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-Avidin ）：1×6ml/瓶。
5. 底物溶液A（Substrate A）：1×6ml/瓶。
6. 底物溶液B（Substrate B）：1×6ml/瓶。
7. 浓洗涤液（Wash Buffer）：1×15ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍。
8. 终止液（Stop Solution）：1×6ml/瓶（2N H2SO4）。
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需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 电热恒温培养箱
4. 超声清洗器
5. 干净的试管和Eppendof管
6. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器
7. 蒸馏水，容量瓶等
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标本的稀释原则：
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
浓洗涤液稀释原则：
临用前用蒸馏水进行20倍稀释。如有盐析出，稀释后水浴加温助溶。
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操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，先进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔不加任何溶液，余孔分别加标准品或待测样品50ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，然后在所有孔中加入50 ul 生物素标记u-T3（空白孔中不加）。尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。酶标板加上盖或覆膜，37℃反应60分钟（为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液）。
2. 温育后，弃去孔内液体，甩干，洗板3-5次，每次浸泡10秒，约200ul/每孔，甩干。
3. 所有孔中加入50 ul辣根过氧化物酶标记亲和素。尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。酶标板加上盖或覆膜，37℃反应30分钟
4. 按步骤2进行洗涤。
5. 依序每孔加底物溶液A和B各50ul，37℃避光显色（30分钟内，一般10-15分钟内，此时肉眼可见标准品的后3-4孔有明显的梯度蓝色，前3-4孔颜色不明显，即可终止）。
6. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
7. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。
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注：
1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。
5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
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洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
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计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
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注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
3. 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
6. 底物请避光保存。
7. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。

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精密度： Intra-assay Precision (Precision within an assay): CV%<8%
Three samples of known concentration were tested twenty times on one plate to assess.
Inter-assay Precision (Precision between assays): CV%<10%
Three samples of known concentration were tested in twenty assays to assess.
 
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样本搜集及储存： Serum: Use a serum separator tube (SST) and allow samples to clot for two hours at room temperature or overnight at 4&deg;C before centrifugation for 15 minutes at 1000 &times;g. Remove serum and assay immediately or aliquot and store samples at -20&deg;C or -80&deg;C. Avoid repeated freeze-thaw cycles.
Plasma: Collect plasma using EDTA, or heparin as an anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 &times;g at 2-8&deg;C within 30 minutes of collection. Assay immediately or aliquot and store samples at -20&deg;C or -80&deg;C. Avoid repeated freeze-thaw cycles.
 
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检测步骤： Bring all reagents and samples to room temperature before use. Centrifuge the sample again after thawing before the assay. It is recommended that all samples and standards be assayed in duplicate.
1. Prepare all reagents, working standards, and samples as directed in the previous sections.
2. Refer to the Assay Layout Sheet to determine the number of wells to be used and put any remaining wells and the desiccant back into the pouch and seal the ziploc, store unused wells at 4&deg;C.
3. Add 100&mu;l of standard and sample per well. Cover with the adhesive strip provided. Incubate for 2 hours at 37&deg;C. A plate layout is provided to record standards and samples assayed.
4. Remove the liquid of each well, don't wash.
5. Add 100&mu;l of Biotin-antibody (1x) to each well. Cover with a new adhesive strip. Incubate for 1 hour at 37&deg;C. (Biotin-antibody (1x) may appear cloudy. Warm up to room temperature and mix gently until solution appears uniform.)
6. Aspirate each well and wash, repeating the process two times for a total of three washes. Wash by filling each well with Wash Buffer (200&mu;l) using a squirt bottle, multi-channel pipette, manifold dispenser, or autowasher, and let it stand for 2 minutes, complete removal of liquid at each step is essential to good performance. After the last wash, remove any remaining wash Buffer by aspirating ordecanting. Invert the plate and blot it against clean paper towels.
7. Add 100&mu;l of HRP-avidin (1x) to each well. Cover the microtiter plate with a new adhesive strip. Incubate for 1 hour at 37&deg;C.
8. Repeat the aspiration/wash process for five times as in step 6.
9. Add 90&mu;l of TMB Substrate to each well. Incubate for 15-30 minutes at 37&deg;C. Protect from light.
10. Add 50&mu;l of Stop Solution to each well, gently tap the plate to ensure thorough mixing.
11. Determine the optical density of each well within 5 minutes, using a microplate reader set to 450 nm. If wavelength correction is available, set to 540 nm or 570 nm. Subtract readings at 540 nm or 570 nm from the readings at 450 nm. This subtraction will correct for optical imperfections in the plate. Readings made directly at 450 nm without correction may be higher and less accurate.
 
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结果计算： Using the professional soft "Curve Expert 1.3" to make a standard curve is recommended, which can be downloaded from our web.
Average the duplicate readings for each standard and sample and subtract the average zero standard optical density.
Create a standard curve by reducing the data using computer software capable of generating a four parameter logistic (4-PL) curve-fit. As an alternative, construct a standard curve by plotting the mean absorbance for each standard on the x-axis against the concentration on the y-axis and draw a best fit curve through the points on the graph. The data may be linearized by plotting the log of the u-T3 concentrations versus the log of the O.D. and the best fit line can be determined by regression analysis. This procedure will produce an adequate but less precise fit of the data.
If samples have been diluted, the concentration read from the standard curve must be multiplied by the dilution factor.

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