【瑞士步琦】通过SFC-50和制备型HPLC对辅酶Q10及维生素C进行纯化

简介

辅酶 Q10（CoQ10，泛醌，2,3-二甲氧基-5-甲基-6-十碳烯基-1,4-苯醌）和维生素 C（抗坏血酸）都是常用的强效抗氧化剂，常作为营养补充剂或用于化妆品中。在护肤方面，维生素 C 可以促进胶原蛋白的生成，减少色素沉着，而辅酶 Q10 则可以保护皮肤免受氧化损伤。作为营养补充剂，辅酶 Q10 有助于降低血压，而维生素 C 则众所周知有助于增强免疫系统。因此，这两种成分经常被一起添加到护肤或营养补充剂中^[1,2]。

辅酶 Q10 存在于鱼油或谷物中，是一种脂溶性维生素样物质，因此它不溶于水。维生素C是一种众所周知的水溶性维生素。因此，挑战在于将这两种维生素分离开来，其中一种（维生素 C）极性很强，而另一种（辅酶Q10）极性很弱。本应用说明展示并比较了使用制备 HPLC 和制备 SFC 分离混合物中的辅酶 Q10 和维生素C。

实验设备

• Pure C-850 

• PrepPure C18 column, 15 um, 150 x 20 mm

• Sepiatec SFC-50 

• PrepPure Silica column, 5 um, 250 x 10 mm

化学品与样品

化学品：

• 甲醇, 色谱级

•  二氧化碳(CO₂)

• 注射器过滤器

• 异丙醇

• 去离子化水

为了安全处理，请注意所有相应的MSDS！

样品：

• 维生素 C（抗坏血酸）

• 100% 辅酶 Q10

辅酶 Q10 购买于当地一家营养商店

实验过程

对于样本，每种物质（CoQ10 营养粉和维生素 C）均用100%异丙醇稀释至浓度为 25mg/mL，然后将样本超声处理 15 分钟。

制备HPLC

• 仪器: Pure C-850

• 色谱柱: PrepPure C18, 15 um, 150 x 20 mm
  

• 流动相: 异丙醇 (IPA)
  

• 流动相条件: 100% 异丙醇等度洗脱

• 流速: 20 mL/min
  

• 检测器: UV1: 254nm

  UV2: 265nm

  UV3: 280nm

  UV4: 320nm

• 进样体积: 1mL

• 平衡时间: 10min

制备SFC

• 仪器: Sepiatec SCF-50
  

• 色谱柱: PrepPure Silica, 5 um, 250x10 mm
  

• 流动相：A = 二氧化碳 (CO₂); B = 甲醇
  

• 流动相条件: 0–2 min: 40% 甲醇
  

• 流速: 20mL/min

• 检测器: 270nm

• 进样体积: 0.1mL
  

• 平衡时间: 1min

结果

制备 HPLC

色谱图（图1）显示维生素 C 在 1.3min 和辅酶 Q10 在 3.5min 的色谱峰，维生素 C 和辅酶 Q10 的最大吸收波长分别为 254nm 和 265nm。

由于辅酶 Q10 在水中不溶性，并且在醇相（如甲醇或乙醇）中的溶解度非常有限，因此溶剂的选择非常有限。

制备 SFC

图2 显示，辅酶 Q10 的色谱峰出现在 1min 后，维生素 C 的色谱峰出现在 1.3min 后。选择 265nm 波长进行检测，这解释了较低的吸光度。由于选择了硅胶作为固定相，非极性的辅酶 Q10 首先流出色谱柱，而极性更强的维生素 C 与硅胶的相互作用更强，因此流出色谱柱的时间较晚。

由于这是一种等度洗脱运行，因此适用于叠加进样。选择了与单次进样完全相同的条件，叠加时间为 0.72min，进样 10 次，如 图3 所示。总运行时间为 8 min，平衡时间为 1.5min。

通过堆叠，1mL 的样品能够得以纯化，这与制备型高效液相色谱（prep HPLC）运行时所使用的样品量相同。在此需要指出的是，制备型超临界流体色谱（prep SFC）中使用的是 250×10mm 的色谱柱，而制备型高效液相色谱（prep HPLC）中使用的则是 150×20mm 的色谱柱。此次堆叠运行的总运行时间为 8 分钟。

Prep HPLC 与 Prep SFC 对比

色谱中典型的分离可分为 5 个步骤：

1. 准备：这包括准备样品，准备溶剂，打开仪器并确保仪器工作。

2. 编辑分离所需设置的方法参数。

3. 在制备 HPLC 的情况下，启动 purge 功能；在制备 SFC 的情况下，清洗泵。

4. 运行：这包括平衡过程和运行过程。

5. 清洗：这一步包括将色谱柱清洗干净并保存，清洗进样阀，用异丙醇冲洗仪器。

时间上的不同

表1 显示了制备型 SFC 和制备型 HPLC 运行之间的时间差异。对于 SFC，最长的时间是将温度加热到 40°C 的柱温 20 分钟。值得注意的是，在此期间用户可以轻松地完成其他任务。对于 HPLC，仪器的开启速度很快，但同样需要准备样品的时间。

两种仪器的运行程序是相同的

如果 SFC 长时间未使用，CO₂ 可能会迁移到泵中，因此在开始运行之前，需要对泵进行 Purge。在所有的 Sepiatec 仪器上，都是通过软件指导您完成这一步。在 HPLC 上，溶剂管路需要手动 Purge。

在 HPLC 中，最长的时间是运行过程。建议平衡 3-5 个柱体积。在这里的应用实例中，平衡是在 4 CV 下完成的。当使用 SFC 时，平衡只需要 2min。

另一个明显的区别是，HPLC 的清洗需要 16min，而 SFC 仪器的清洗仅仅需要 2min。在 HPLC 运行结束时，有必要将色谱柱保存在 80%MeOH/20% 水的条件，而在 SFC 中，色谱柱可以在运行结束时存储，不需要任何额外的步骤。对于 SFC，唯一需要的清洁是冲洗进样器。而为了确保 HPLC 始终处于工作状态，在关闭仪器之前需要用异丙醇（IPA）冲洗仪器。这增加了另一个步骤，这在使用 SFC 仪器时是不必要的。

表1：制备型 SFC 和制备型 HPLC 纯化等量样品的时间差异。

溶剂消耗上的不同

在两种方式中，样品制备都需要 IPA，这也是 HPLC 运行所选择的流动相。SFC 方法采用甲醇和 CO₂。HPLC 需要额外的溶剂来保存色谱柱，如水和甲醇。水是一种绿色流动相，但由于它与仪器中的溶剂混合在一起，因此仍然需要丢弃在化学废物中。在 表2 中显示，在 HPLC 运行中产生的溶剂浪费比 SFC 运行多 7.5 倍。

表2：制备型 SFC 和制备型 HPLC 纯化等量样品的溶剂消耗差异。

结论

CoQ10 和维生素 C 这类脂溶性和水溶性化合物的混合物可以用制备型 HPLC 和制备型 SFC 分离，HPLC 的固定相为 C18，即极性的维生素 C 先洗脱，非极性的辅酶 Q10 后洗脱。SFC 所用的固定相为二氧化硅，洗脱顺序相反。纯化等量样品时，SFC 系统的操作时间（40 min）比 HPLC 系统的操作时间（58 min）短得多，除此之外，SFC 所用的溶剂相较于 HPLC 减少了约 7.5 倍。

参考文献

1. Wu, H.-S., Tsai, J.-J., Separation and purification of coenzyme Q10 from Rhodobacter sphaeroides. J. Taiwan Inst. Chem. Eng. (2013), http://dx.doi.org/10.1016/j.jtice.2013.03.013.

2. See, X. Z., Yeo, W. S., & Saptoro, A. (2024). A comprehensive review and recent advances of vitamin C: Overview, functions, sources, applications, market survey and processes. Chemical Engineering Research and Design, 206, 108–129 https://doi.org/10.1016/j.cherd.2024.04.048.