通过上期的介绍,我们已经知道,生物发光和荧光作为最常见两种光学成像技术,各有特点。其中生物发光技术因其背景噪音低,灵敏度高等优点,在肿瘤,分子互作及信号传导等研究中得到了广泛应用。当两种方法都适用于研究对象时,更推荐用生物发光标记方法开展成像实验。
一个完整的生物发光实验流程,至少应包括实验设计(选择合适的荧光素酶报告基因和荧光素底物)、细胞培养与转染(将荧光素酶报告基因转染至细胞中,使其表达荧光素酶)、动物模型准备(选择适当的动物模型,并根据需要进行基因编辑或诱导特定病理状态)、细胞注射或移植(将标记细胞注射或移植到动物模型中)、荧光素底物注射(在成像前向动物注射底物,可通过腹腔注射、静脉注射或口服等方式)、成像观察(使用高灵敏度的活体成像系统,在预定的时间点捕捉生物发光信号)等。
本期,我们将深入探讨生物发光活体成像系统的实验技巧,从荧光素的选择到实验结果的分析,逐一探讨生物发光实验的注意事项及技巧。
荧光素的选择
荧光素酶与荧光素的化学反应是生物发光的基础,选择合适的发光酶和底物是实验成功的第一步。生物发光活体成像系统常用的发光酶包括萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶等。实验一般选用萤火虫萤光素酶,有时也会用海肾萤光素酶。
二者区别如下表所示:
体外验证
将构建的细胞加入150μg/ml D-luciferin 底物溶液2分钟后使用IVScope小动物活体成像系统观测,然后进行生物发光的定量分析。
计算单个细胞单位时间发出的光子数,当数值大于100时,适合进行体内实验,数值过低或过高,都不适合体内成像或长期观测。将定量数据绘制标准曲线,计算标准差,线性好证明细胞表达稳定,线性差则表明荧光素酶表达不稳定,同样不适合进行体内实验。
细胞接种
确保细胞是在良好的生长状态下,并且已经稳定转染或转录了荧光素酶基因。在接种前,使用细胞计数器或自动细胞计数仪对细胞进行准确计数。接种部位和数量应根据实验需求进行调整,将细胞接种到实验动物体内。确保细胞在体内生长、扩散,以产生稳定的发光信号。
荧光素底物注射
将萤光素或其它底物注射入实验动物体内。实验总结出荧光素的合适的用量是150mg/kg,即体重20克的小鼠需要3毫克的荧光素。注射方式有静脉注射、腹腔注射、鼻吸(i.n.)或其他方式。
腹腔注射(i.p.):腹腔注射扩散较慢,持续发光长。
静脉注射(i.v.):血液运输,灵敏度高,重复性好。信号来的快,去的也快
鼻吸(i.n.):适合于肺部成像
根据实验目的和动物模型的特点,选择合适的注射方式。注射时,需注意注射速度、剂量和浓度,以确保发光信号在体内均匀分布。
体内预实验确定最佳成像条件
在正式实验前,进行预实验以确定发光时间线和最佳拍摄时间。一般情况下,腹腔注射底物约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光,十分钟后强度达到最高。在最高点持续约20-30分钟后开始衰落,约三小时后发光全部消失。所以合适的检测时间是在注射后15-35分钟内。
麻醉方法
为减少实验动物在成像过程中的运动干扰,需对其进行麻醉。选择合适的麻醉药物和剂量,确保动物在成像过程中处于稳定状态,保证获得的实验数据准确可靠,又能最大限度地保障动物福利,确保其安全。实验动物一般较难合作,因此实验中常采用全身麻醉,根据麻醉方式分为吸入麻醉和非吸入麻醉。
吸入麻醉与注射麻醉的区别如下表:
成像设备的选择
在生物发光实验中,合适的仪器对确保实验结果的准确性和可靠性至关重要。
理想的成像仪器应具备以下特点:
1. 高灵敏度
选择具有高灵敏度的仪器,以便检测低水平的信号,这对于早期疾病检测和微小变化的监测至关重要。
2. 高分辨率
考虑仪器的动态范围和分辨率,高分辨率仪器能够提供更清晰的图像,有助于更精确地定位和量化生物学过程。
3. 宽动态范围
仪器应具有宽广的动态范围,能够同时检测到从低到高的信号强度。以保证在不同条件下都能获得清晰的信号和高质量的图像。仪器的背景噪声应尽可能低,以提高信噪比。
4. 操作便利性、环境适应性及样本兼容性
选择用户界面友好、易于操作的设备,且能够适应不同的实验条件和样本类型。考虑仪器与其他实验设备的兼容性,以及未来升级或添加新功能的潜力。
5. 良好的技术支持和服务
确保在遇到操作或技术问题时能够得到及时有效的帮助。综合这些因素,选择适合的生物发光实验仪器,将有助于提高实验的成功率和数据的质量。
实验结果判读和分析
获取高质量的成像数据只是研究的一部分,结果的判读与数据分析同样重要。它能帮助研究人员从图像中提取有价值的信息,并得出科学结论。
1. 图像优化处理:采用软件对拍摄到的图像进行优化处理、灰度调节、伪彩色处理等,以提高图像质量。
2. 定义感兴趣区域(ROI):计算发光强度、发光面积、发光信号变化等参数,分析实验结果。可使用统计学方法对数据进行处理,以得出有意义的结论。
3. 多图分析:不同时间点成像结果的分析要用到多图分析,数据归一化有助于消除偏差,批量ROI圈选及计算,生成动力学曲线、批量导出图片及动态展示等提高了结果的可读性和理解性。
结论
综上所述,生物发光活体成像在实验过程中涉及多个环节,掌握各个方面的技巧和方法对于获得可靠、准确的实验结果至关重要。
Q&A
最后在仪器操作方面,为大家提供的常见的一些问题及解决方法:
1. 正常成体小鼠可以看到体内发光吗?是否不需要裸鼠?
可以。成体老鼠和裸鼠,幼鼠及胚胎的区别只在于对可见光的穿透性不同,通过仪器可以看到正常老鼠的体内发光。可见光的穿透能力在3-4cm,所以大鼠也可以作为活体成像的动物。
2. 拍摄图片模糊不清可能原因是什么?怎么解决?
可能是焦距没有调整到位,预览状态下拍摄样本就不清晰。
解决方法:重新调整样品台高度,并使用聚焦按钮进行精确调焦,确保拍摄主体清晰。
3. 预览曝光时间怎么调整?
预览曝光可以帮助您更清晰地观察样品,并优化拍摄效果,预览曝光时间应根据样品的亮度和对比度进行调整。在预览模式下,点击曝光时间显示区域,输入新的曝光时间值,或使用上下箭头按钮进行调整。同时观察预览图像效果,直到找到合适的曝光时间,保证图像清晰,避免过曝或欠曝。
4. 拍摄图片曝光过度或不足怎么解决?
调整曝光时间,根据样品信号强度选择合适的曝光时间,可以选择手动曝光模式,根据实际情况手动设置曝光时间。
5. 实际拍摄时,我到底是使用手动曝光(固定曝光时间)还是自动曝光?
从实验设计角度看,手动曝光是可以的,每个时间点的曝光时间固定,后期可以放在一起比较。但从实际操作角度来看,曝光时间具体多少很难确定,很容易过曝或者拍不出信号。
推荐使用自动曝光,多图分析时切换到时间归一化单位(cts/s,photons/s,p/s/cm2/sr等)就可一起比较。
6. 图片分析结果不准确怎么解决?
分析结果不准确可能是由于ROI 选区不准确,或者背景扣除不当。应仔细选择 ROI 选区,确保只包含目标信号区域,避免包含背景或非特异性信号。调整背景扣除参数,去除背景信号的影响,确保分析结果的准确性。
7. 软件运行出现错误怎么解决?
软件运行出现错误可能是由于软件版本与硬件不兼容,或者软件安装不完整。应确保软件版本与硬件兼容,参考软件安装指南重新安装,确保软件安装完整。
8. 软件支持哪些图片格式,源文件怎么保存?
软件支持多种图片文件格式,例如 TIFF、JPEG、PNG 等。可以根据需要进行选择合适的图片文件格式保存,例如 TIFF 格式可以保存图片的完整信息,但文件体积较大;JPEG 格式可以压缩图片,但会丢失一些信息。
源文件会自动保存,软件默认的源文件保存路径为硬盘最后一个分区:\Capture Images\当天日期,你可以根据需要进行修改保存路径,例如可以将图片文件保存到指定的文件夹或硬盘分区中。
9. 软件出现“相机未连接”或“控制板未连接”怎么解决?
出现“相机未连接”或“控制板未连接”可能是由于USB 数据线连接问题或USB 驱动问题,请检查 USB 数据线是否牢固地连接到主机后侧的 USB 接口和电脑的 USB 接口,确认电脑的 USB 接口是否为3.0接口;
检查电脑是否已正确安装 USB 驱动程序。您可以尝试重新安装驱动程序。
重启软件和电脑,按照先开电脑,再开软件的顺序重新开启仪器和软件。
如以上步骤未能解决,请联系厂家获取帮助。
10. 多图分析功能如何使用?
IVScope 8000X 系列小动物活体成像系统的 Clinx IVScopeEQ Capture 软件提供了多图分析功能,方便用户进行批量图片的对比分析。允许用户一次性导入多张图片,可以选择不同的排列方式、伪彩样式,并在归一化背景下对多张图片同时进行 ROI 分析,比较不同区域的数据。可以设置不同的 ROI 类型,例如圆形、椭圆形、矩形等,可以导出 ROI 数据。用户可以将多张图片导出为不同的格式,例如 TIFF、JPEG 等,可以选择导出全部图片或部分图片,还可以预览及导出动图。
Clinx IVScopeEQ Capture 软件多图分析功能强大且易用,可以帮助用户更方便地进行批量图片的对比分析,从而获得更准确和可靠的实验结果。
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