干货分享：PCR体系构建，“酶”有选择

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅增加。整个PCR反应过程中有几种不可或缺的物质，酶就是其中一种。不同的酶有不同的试验特性，根据其特性又可以应用在不同的场景中。如何选择试验中最适合的酶是我们在试验之初值得思考的问题，下面小编就带大家一起了解一下PCR实验中几种常见的酶。

TaqDNA聚合酶

PCR试验之初使用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，但由于每一个循环都需要补充新的酶，其操作步骤稍显复杂。1988年科学家们从水生栖热菌中分离得到了Taq DNA聚合酶，从此DNA的自动扩增变成现实。也是由于这个酶的发现使PCR成为了一项便利、实用、普遍的技术。Taq DNA聚合酶也成为了DNA试剂盒中最为常见的一种聚合酶。

野生的Taq DNA聚合酶虽然已经具备良好的功能性以及广泛的应用范围，但由于分子诊断技术要求的精确性及各项要求越来越高，因此对其扩增能力、保真性、耐热性等方面进行优化。从而提高Taq DNA酶在分子诊断中的稳定性、灵敏度以及特异性。

改造后的Taq DNA酶具有以下优势：

1良好的耐热性，最适催化浓度为75-80℃，95℃半小时后仍保留50%以上的活性。

2有5’-3’聚合活性，这一特性使TaqDNA酶对温度有较高的敏感性。

3有5’-3’外切酶活性，TaqDNA酶也是少数具有这一特性的DNA聚合酶之一。

4可以在PCR产物3’末端添加无模板核苷酸，这一特性可以使TaqDNA酶的PCR产物直接用于TA克隆。

但它没有3’-5’的校正活性，可能在PCR反应中引起错配，这一缺点使其在PCR扩增中的忠实性大幅度降低。

PfuDNA聚合酶

为了避免因错配而出现的非特异性扩增，造成试验结果不准确，科学家们对Taq DNA聚合酶进行了修饰。而PfuDNA聚合酶正是利用了酶的修饰物在常温下抑制DNA聚合酶活性，加热至变性温度时修饰物失活，释放酶活，从而使PCR反应得以正常进行。它可以很好地弥补Taq DNA聚合酶的劣势，有效提高目标基因的扩增成功率，因此应用范围较广。目前市面上常用的PfuDNA聚合酶修饰方法主要有化学修饰法、配体修饰法和抗原抗体结合法，修饰原理不同其优劣势各有不同。

1化学修饰法

利用化学小分子和DNA聚合酶活性中心结合封闭酶活，当温度为95℃的时候酶活性释放。

优点：酶活性维持更加稳定且无任何外源DNA污染，性价比高。

缺点：酶激活的时间较长，可能会影响酶的活性，导致PCR产物的产量降低。

2配体修饰法

核酸适配体（一般指一类具有特异性识别功能的单链核酸分子，DNA或者RNA）通过非共价键作用与聚合酶结合封闭酶活。当温度高于60℃酶活性释放。

优点：不需要激活步骤，稳定性高，减少了样本降解的可能性。

缺点：由于核酸适配体是一种可逆抑制剂，较化学修饰法来说稳定性较低，特异性不够强。

3抗原抗体结合法

是当前最常用的一种方法，利用DNA聚合酶抗体与聚合酶进行结合封闭酶活性，当温度到达变性温度时（95℃）开始释放酶活性，可以大大避免错配或引物二聚体引起的非特异性扩增。另一方面针对低丰度基因，封闭抗体在避免预变性前的DNA聚合酶和模板的非特异性结合的同时，增加了引物与微量的正确模板碰撞退火的效率，从而保证低丰度基因的有效检出，大大提升反应灵敏度和扩增效率。

优点：酶激活时间短，保证酶活，亲和力强，灵敏度高。

缺点：抗体生产成本高，试剂配比优化时间长。

逆转录酶

1970 年Temin发现了逆转录酶，该酶以RNA 为模板，以dNTP 为底物，根据碱基配对的原则，按5'-3'方向合成一条与RNA 模板互补的DNA 单链。

逆转录酶具有依赖于DNA或RNA模板的DNA聚合酶活性，因此没有3’-5’外切酶活性。但其具有RNase H活性，在一定程度上限制了逆转录酶的合成长度。由于野生逆转录酶的保真性和热稳定性较低，因此科学家们对其进行了改造。

常见的逆转录酶主要有HINV1 RT、AMV RT、M-MLV RT，但由于前两种酶的应用范围较窄，因此研究者们主要针对最后一种逆转录酶不断进行升级改造。升级后的第三代逆转录酶整体性能有了明显的提升，表现在有更高的cDNA产量、更广的温度范围以及可以适用于复杂结构RNA模板，提升了cDNA的合成长度。虽然第四代的性能更好，但由于其价格过高，实际应用并不广泛。

第三代逆转酶主要有以下优势：

1卓越的延伸能力

2灵敏的检测范围

3优良的耐热特性

4高效的扩增性能

5超高的合成速度

Bst链置换DNA聚合酶

1972年Stenesh和Roe首次从嗜热脂肪芽孢杆菌中分离了Bst链置换DNA聚合酶，与Taq DNA聚合酶有相似的结构域。经基因工程改造去除了DNA聚合酶Ⅰ的 5’-3’核酸外切酶活性，但保留了 5’-3’ DNA 聚合酶活性和强链置换活性。

Bst链置换DNA聚合酶作为等温扩增的核心酶，其优势十分明显：

1微量、高产扩增

2高灵敏度、特异性RT-LAMP扩增

3快速反应，可以在一个小时的时间内完成整个试验

其缺点为不具有5′→3′外切核酸酶活性，因此没有纠错功能。

不同的酶由于优劣势各有不同因此其常见的应用场景也各有侧重。Taq DNA聚合酶的应用范围十分的广泛，可应用于常规PCR扩增、易错PCR扩增、位点特异性PCR、RT-PCR、qRT-PCR，同时也是探针法qPCR技术的指定聚合酶；使用热启动Taq酶是提升PCR特异性的常用方法，因此热启动Taq酶常用于qPCR反应中，除此之外，由于其较高的特异性和高灵敏度，也经常被用于构建DNA文库、DNA测序、突变体的分析构建、基因分离、遗传病诊断、法医鉴定等；逆转录酶可以为qPCR合成第一链cDNA，有构建cDNA文库、DNA测序、末端标记DNA等作用；Bst链置换DNA聚合酶适用于较低温度下（68℃）的DNA测序、防污染的等温扩增反应，如 LAMP 等。