使用HR-MAM对 NIST单抗的关键质量属性进行监控

随着治疗性生物产品在全球药物市场所占份额的不断提高，各 国监管机构通过发布质量源于设计（Quality by Design, QbD） 原则等手段，对生物药的质量控制提出了更高的要求。对于生 物制药企业而言，在生产及批次放行过程中对关键质量属性 （critical quality attribute, CQA）和杂质等进行鉴定、定量和监 控就显得尤为重要。传统的质控手段包括多种分离手段，如反 相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)、体积排阻色谱（size-exclusion chromatography, SEC）、离子交换色谱（ion-exchange chromatography, IEX）和毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）等。

　　2015年，Rogers等基于Orbitrap高分辨质谱平台发展了MultiAttribute Method（MAM），用于在一针进样中同时对CQA进行 鉴定、定量和实时监控[1]。自从MAM发布以来，获得了业界的 极大关注，在近年的学术会议中屡屡成为热点议题[2]。 在本文中，我们使用Thermo Scientic™ Q Exactive™ Plus Orbitrap™ 高分辨质谱平台，串联Thermo Scientic™ Vanquish™ Flex UHPLC系统，使用Thermo Scientic™ Chromeleon™ 7.2.9 Chromatography Data System (CDS) 与Thermo Scientic™ BioPharma Finder™ 3.2 软件进行数据采集和处理。

Figure 1. Thermo Scientic HR MAM 工作流程图. 使用BioPharma Finder 软件对肽图分析的数据进行分析，与发现阶段进行对比以鉴定CQAs； 随后将BioPharma Finder生成的CQA列表导出至变色龙CDS中进行常规 GMP阶段符合合规要求的目标组分检测。

　　参考之前的报道，在本文的研究中我们选定了如下的CQAs用于 定量：糖基化（glycosylation）、脱酰胺（deamidation）、天 冬氨酸异构化（isomerization）和C端赖氨酸丢失（C-terminal lysine truncation）。对于每个CQA，我们选取了鉴定到的每个 电荷态的前四个同位素峰，在BioPharma Finder中另存为Target Peptide Workbook，并一键导出为BioPharma Finder workbook le (.wbpf)，随后将其导入变色龙 Processing Method中的 MS Component Table。

　　任何新发现的CQA可以随时添加进BioPharma Finder workbook 和变色龙方法中，这为方法开发和优化阶段提供了极大的灵活 性。一旦在变色龙软件中建立了标准化的分析方法，即可将该 方法应用于GMP环境下的应用中。 接下来，使用Chromeleon CDS 7.2.9软件进行CQA定量。我们 基于变色龙软件中的MS Quantitative模板创建了MAM数据处理 的方法，基本参数如表4所示。在变色龙软件中，可以对峰积分 的参数进行优化，以确保积分结果一致且可信，从而得到准确 的定量结果。

　　实验结果

　　本次实验选取的两份NIST mAb标准品来源于同一批次，通过 对比不同溶液置换耗材处理后选定CQA含量的变化趋势，进而 研究不同耗材对CQA定量结果的影响。图2展示了Biopharma Finder对两个样品进行肽图分析的结果，可见在上样量约4μg肽 段的情况下，NIST mAb标准品轻链覆盖度≥96%，重链覆盖度 ≥98%，除了一些胰酶酶切过短的肽段没有鉴定到，其余区域均 可鉴定到肽段信息，为CQA的选取和定量提供了坚实的基础。

Figure 2. 两份NIST mAb标准品（RA2, 上；RA3, 下）酶解肽段基峰谱 图（Base Peak Chromatogram）. 对于两个样品，我们分别进行了三针技术重复。表5展示了对主 要糖型的定量结果。由图中可以看出，分别使用不同前处理耗 材的两个样品的六针进样之间均呈现良好的重现性。

　　结论

　　在本实验中，我们使用基于Thermo高分辨质谱平台的HR-MAM 流程对在前处理步骤中使用不同溶液置换耗材的NIST mAb标准 品进行了CQA的鉴定和定量。得益于HR-MAM流程的稳健性、 灵活性、特异性和高灵敏度，我们可以在一次实验中同时对多个 CQA进行监控和定量。 对比不同溶剂交换前处理耗材的实验结果，可发现肽图强度、色 谱峰型及分离与肽图覆盖度等无明显差异，且与关键质量属性相 关的特定修饰，使用不同耗材处理得到的定量比率并无显著区 别，更进一步证明了HR-MAM流程的稳定性。