高分辨质谱平台实现mRNA mapping流程化

Nuclease T1是一种真菌核酸内切酶，可切割鸟嘌呤残基后的单链RNA，具有较强的特异性，常用于核酸测序应用。但由于核酸内切酶效率很高，酶解时间较难控制，且传统的溶液酶解方法会使核酸酶残留在分析柱上造成污染。基于以上需求，赛默飞推出了一款前处理磁珠RNase T1 Mag Bulk Kit，将Nuclease T1酶固定在磁珠上，通过简单快速的磁铁吸附及可有效控制酶解时间，并去除溶液里的T1酶，该方式可以有效提高实验的重现性并降低酶的干扰（如下图）。

a) 将样品配成200 μL体积放于eppendorf管中（如下图a所示），置于酶解仪中震荡孵育（37-50℃, 2000 rmp）5min ，通过磁铁吸附的方式将酶解上清与磁珠分离，再加入1%甲酸终止反应；

b) 采用全自动磁珠纯化仪，反应、分离及纯化均可根据设置好的程序进行自动操作，适用于高通量前处理需求（图b）。

色谱分离采用一款专用于核酸分析的色谱柱，Thermo Scientific™ DNAPac™ RP，该色谱柱由球形宽孔径 4 µm 聚合树脂构成，可耐受极端 pH (0-14) 和温度 (5-110°C) 条件，在HPLC 和UHPLC仪器上均可使用，针对寡核苷酸可实现高分辨率和高通量，较小和极大的核酸链均可分辨(如下图A)。

图B显示DNAPac™ RP色谱柱的各类型号，mRNA mapping建议选用2.1*100 mm型号。

核酸样品吸附性强，而生物惰性液相系统吸附低；其次离子对试剂易腐蚀液相系统管路及接口，因此建议使用生物兼容的Vanquish UHPLC系统。

液相方法如下图：

新一代Orbitrap Exploris系列产品具有体积小、性能高、操作简单等优势，扩展了Q Exactive系列质谱仪器的分析能力。如下图a所示，内置的AcquireX数据采集工作流程，为各种不同类型的应用设置参数模板，一键调用，可进行全面自动化的样品分析；且带有EASY IC离子源内标校正，保证仪器的高质量精度；更快的扫描速度可提高样品分析通量。图b显示mRNA mapping的方法模板：在peptide mode模式下，一级采用120，000分辨率，二级30，000分辨率；负离子扫描模式；stepped NCE 25,28,31 。该方法模板可一键调用，操作简便，且得到高质量的谱图。

Biopharma Finder软件可实现核酸样品自动化数据分析，如下图a所示，软件支持DNA及RNA样品序列管理，可自定义核酸骨架和可变修饰，操作简便；对二级谱图进行自动化注释和解析；寡核苷酸杂质定性和相对定量分析；多批次样品含量变化趋势比对。

图b 展示定结果图表，列表里的每一行代表一条鉴定的核酸链，右上方对应的理论及实测二级图谱，将图谱里响应很低的峰放大，可以清楚的看到碎片离子的同位素峰，结果可信度高。

Biopharma Finder 4.1版本在寡核苷酸分析的基础上增加了长链mRNA mapping的功能，在数据处理方法中增加核酸酶模块，有常见的几种酶供选择，也可自定义添加酶。下图展示mapping分析结果，对于mRNA样品中每一条确证序列的片段，均可溯源详细信息，如在序列中的位置、一级和二级谱图、可信度、定量信息等。

得益于Orbitrap仪器采集的高质量图谱，在核酸分析结果里几乎每一条链都可实现一百%序列覆盖（Average Structural Resolution=1.0），这对于区分同分异构体非常有帮助。前面我们提到mRNA由4个特定碱基构成，在其酶解片段中出现同分异构是常见的现象，如下图，当仪器检测到足够多的碎片离子，可以确证同分异构的两条链里的每一个碱基，即可轻松区分两条分子量相同，序列不同的片段。

对于长链RNA片段，如下图具有13个漏切位点，48个碱基长度的片段，也可鉴定到每一个碱基，得到高可信度结果。酶解片段越长，其序列特异性越强，对于RNaes T1酶解无法覆盖的短片段，也可采用mazF酶解得到的更长片段作为互补信息。

案例分享：

参考文献：