【综述】一文了解新冠病毒即时检测技术进展

本文亮点

1.总结了各种检测SARS-CoV-2的扩增分析和传感技术。

2.生物传感器必须实现定量输出，以获得更准确和便捷的结果。

3.小尺寸检测平台的开发可实现在手机APP、LFA、生物传感检测技术等方面的应用。

内容简介

2019年12月以来，在急性呼吸道疾病患者中发现了一种新的人畜共患病的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。由于其爆炸性的传染速度，迫切需要像PCR和ELISA等临床检测来快速检测该病毒，以便及早识别受感染的患者。然而，这些技术很昂贵且不适用于即时检测(POC)。目前，缺乏快速、可用和可靠的POC检测方法，导致新冠肺炎成为一个可怕的全球性传染的危机。南京林业大学Yasin Orooji教授和电子科技大学Hassan KarimiMaleh教授等回顾了自SARS病毒被发现以来对人类产生致命危害的冠状病毒，并着重系统的总结了SARS-CoV-2病毒现有的病毒检测技术手段和最新的研究进展。本文详细介绍了冠状病毒的一般特征，描述了各种冠状病毒的扩增分析、传感、生物传感、免疫传感和适配检测方法，并将其作为检测SARS-CoV-2的模板。并且讨论了目前用于识别新冠状病毒(SARSCoV2)的每种技术的检测机制、优缺点。

I 冠状病毒

冠状病毒科是一个单链RNA病毒家族，包含27-32 Kb的阳性病毒基因组，由双层脂质膜覆盖，表面有大量蛋白颗粒或尖峰，直径约120 nm(图1)。该科隶属于套式病毒目(Nidovirales)，分为两个亚科，6个属，23个亚属，约40种。两个亚科，分别为冠状病毒亚科(Coronavirinae)和环曲病毒亚科(Torovirinae)，都可能涉及人类；然而，就涉及的范围和发病率而言，冠状病毒亚科相对更具有危害性。一旦冠状病毒开始感染人细胞，S蛋白就会将病毒颗粒附着在其宿主细胞上，从而促进病毒的脱壳过程并引发感染(图2)。肽酶是用作冠状病毒的主要受体蛋白质，例如SARSCoV和SARSCoV2以及HCoVNL63通过与ACE2或MERSCoV结合感染细胞同时使用DPP4作为进入宿主细胞的方式。

图1. 人类冠状病毒的动物来源(自然宿主和中间宿主)；感染SARS-CoV-2的患者的临床表现；以及常见的冠状病毒及其结构。

图2. SARS-CoV-2复制周期示意图。

II 检测方法

与其他病毒特别是呼吸道病毒相比，新型冠状病毒SARS-CoV-2具有很高的传染性，可以通过近距离接触传播、飞沫传播甚至环境传播。尤其是无症状病毒携带者进一步增加了病毒的传染风险。针对新冠肺炎的这些特点，设计针对该病毒的特异性诊断方法尤为重要。

图3. SARS-CoV-2不同检测技术发展概况。

III 胸部CT

胸部CT扫描是一种利用X射线发现肺组织改变的X线摄影和医学成像，通常有助于呼吸道病毒感染(如冠状病毒感染)的非特异性诊断。在中国武汉对新冠肺炎患者进行的一项研究表明，CT扫描的灵敏度约为98%，与RT-PCR71%的灵敏度相比尤为重要。但CT扫描的表现通常是非特异性的，与其他类型的肺炎相同。而将这种影像学与其他诊断技术(例如实时PCR或生物传感)相结合作为确认对识别COVID19患者是非常有意义的。

IV 实时PCR

在过去的几十年中，基于核酸的病毒检测已被用于确定病毒基因组的特定序列，从而确认根据症状推测的病毒感染类型。与其他类型的PCR技术相比，实时PCR具有一些优点，包括提高过程速度、缩短循环时间、去除等PCR后程序(如凝胶电泳)、减小扩增子大小以及量化病毒检测。尽管实时PCR检测的准确性和特异性很高，但这种检测既耗时又昂贵，而且还需要专业人员。

此外，临床标本中冠状病毒RNA的检测需要专业仪器和RNA提取纯化试剂盒，因为细胞RNA也是与病毒RNA一起提取的，这会干扰病毒的扩增和检测机制。因此，该测试不能用作快速测试。另外，考虑到RNA基因组的不稳定性以及RNA的收集和提取方法，假阴性的机会也会增加。而且，RT PCR测试不能判断患者是否接触过这种疾病并已经康复，或者他们是否更有可能感染这种疾病。冠状病毒还可以使其基因发生突变，这可能会使引物无法检测其特定的目标。然而，检测病毒基因组中的保守区可以改善问题的发生率，例如检测在大多数冠状病毒基因中都很保守的5’UTR区。

V 环介导恒温扩增(LAMP)分析

环介导恒温扩增(LAMP)是一种新型的DNA分子诊断技术，在恒温条件下具有灵敏度高、特异性强、成本低、效率高、快速性好等优点，是常规PCR的10倍以上。不同于传统的PCR需要一系列重复的温度变化和3-40个循环，LAMP不需要温度循环，是在恒温(60-65°C)下进行的。LAMP只使用了一组4个特异引物和一个DNA聚合酶(例如，BST DNA聚合酶的大片段)，具有复制活性和高链置换活性，在不到1小时的时间内扩增出高达109 拷贝的目的基因。

LAMP技术也用于使用逆转录酶(RT)和称为RT-LAMP的DNA聚合酶来检测RNA序列。放大的产物可以用光度法测量，直观地显示副产物焦磷酸镁在溶液中沉淀造成的混浊。溶液中的任何变化都可以用肉眼或通过使用SYBR绿等荧光染料进行非常简单的光度技术来观察。这项新技术正被广泛用作检测病毒感染的一种强有力的替代方法。

在之前的应用中，RT-LAMP方法被用来在63°C的反应温度下在11分钟内检测到高致病性冠状病毒，如SARS-CoV，这有助于在2003年SARS-CoV暴发期间快速诊断这种感染。LAMP方法有可能成为检测新型冠状病毒SARS-CoV-2及其相关病态新冠肺炎的装置的候选方法。目前已经有团队设计了一些新的RT-LAMP方法来检测新冠肺炎的病原体，可以在63℃下30分钟内完成检测。甚至还有团队设计出的方案中，检测时长只需要15分钟左右。这种新的方案会更实用，既加快了检测过程，又方便了检测。总而言之，LAMP技术最重要的优点是它提供的时间更少，省去了耗时的过程，并且需要恒定的温度，从而省略了PCR技术中最关键的步骤——热循环器步骤。

除优点外，LAMP技术也有一些限制其应用的局限性。LAMP技术使用引物组(在4到6个数字之间)，并针对单个DNA或RNA的几个区域，所以这些引物的设计需要高能力和先进的工具和软件，这些工具和软件比PCR技术要耗时和困难得多。LAMP的其他局限性包括需要使用带有退化序列的引物来检测感染，特别是不同类型的病毒，这只有通过使用PCR检测作为诊断技术才是可行的。LAMP技术中每个靶的大量引物极大地增加了在这一检测过程中引物-引物相互作用的可能性，与PCR相比，这可能会对检测的特异性产生显著影响。LAMP技术的另一个主要缺点和局限性是DNA产物的连续存在，这会导致在凝胶电泳步骤之后出现几条带，而不是在凝胶上有一条带，这使得很难检测到每一条带。

VI 酶联免疫吸附测定(ELISA)

ELISA检测是基于抗原和抗体之间的相互作用(图4)，使用一种酶以可测量的方式显示和转换读数。到目前为止，已经定义了几种ELISA方法，它们是基于平板底部包被的物质或测定吸光度和准确浓度的方法。一般来说，这项测试有几个问题，这使得它在某些情况下是不合适的。这些问题包括假阴性、样本产生的噪声反应、由于不适当的平板清洗而导致的不特异性反应、耗时、准备的ELISA试剂盒中试剂浓度的差异、价格昂贵，以及需要具有触发免疫分析、使用ELISA读取器和其他相关设备以及计算抗原或抗体的确切数量的操作人员的技能。

图4. 检测SARS-CoV-2的ELISA技术。

VII 传感方法

传感器是出色的分析工具，可以与特定分析物可逆地、选择性地相互作用，并将输入的可测量化学参数转换为特定化合物的浓度和可分析的电响应。到目前为止，各种传感器已经被用来检测各种病毒，如人类冠状病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和寨卡病毒(Zika Virus)等。

压电弯曲平面波(FPW)是一种高灵敏度、高灵敏度的超灵敏诊断仪，可以测量振动元件的质量。这些微型器件通常是通过在材料表面或具有压电特性的衬底上形成换能器来创建的。为检测SARS冠状病毒，研制了便携式微型FPW系统。以人血管紧张素转换酶2(HACE2)为功能性受体，研制了检测SARS-S蛋白的功能化FPW生物传感器(图5)。

图5. 一种弯曲平面波传感器芯片。

基于纸张的DNA比色传感器可作为选择性、灵敏、快速、简便的MERS冠状病毒cDNA检测的替代方法(图6)。纳米颗粒呈现出高度复杂的规格，使它们能够成为任何新颖和有前途的生物创新的一部分。例如，它们的大小和形状可以改变，并且它们的大表面提供了将各种化学基团合并为可用结合位点的平台。正因为如此，通过多重相互作用和主动靶向成像来感知和诊断病毒感染，改变这些纳米材料对靶分子位点检测的生物学功能是可能的。最常见的用于病毒感染治疗或检测的金属纳米粒子有银纳米粒子、金纳米粒子、二氧化硅和介孔纳米粒子、碳纳米管、氧化铁纳米粒子等。

图6. 一种基于纸张的DNA比色传感器。

VIII 生物传感分析

针对不同的病毒，特别是人类冠状病毒，目前报道了各种各样的光学生物传感器，包括等离子体共振(SPR)、椭圆偏振和反射干涉光谱(RIfS)、比色、荧光和表面增强拉曼散射(SERS)等传感器。在这些光学生物传感技术中，SPR生物传感器是非常重要的，因为它们可以直接测量传感器表面光的折射率发生的变化，反映被分析物的浓度。为实现SARS冠状病毒的快速、高通量检测，研制了一种基于表面等离子体共振(SPR)的生物传感器，该传感器是一种实时、无标记的检测系统，可用于SARS冠状病毒的快速、高通量检测。下面介绍两种SPR传感器：

8.1 抗体模拟蛋白(AMP)生物传感器

基于AMP(纤维连接蛋白)为捕获剂的纳米线生物传感器被引入到SARS冠状病毒的检测中，该传感器对核衣壳蛋白(N)蛋白有很高的亲和力。该蛋白具有很强的抗原性，可能成为一种合适的诊断生物标志物。研究的结果表明，与其他诊断技术如qRT-PCR和ELISA方法所需的较长时间(几个小时)相比，N蛋白可以在亚纳米级的浓度下检测到，反应时间短(~10 min)，并且不需要任何必要的多步分析。这份研究展示了所制造的纳米生物传感器作为一种精确、合适和快速的手段来检测作为SARS-CoV感染生物标志物的N蛋白的能力(图7)。

图7. In₂O₃纳米线FET器件外部固定化FN的示意图。

8.2 融合蛋白SPR传感器

如图8，这里开发了另一种基于SPR的生物传感器，可使用重组蛋白将金结合多肽(GBP)与SARS冠状病毒表面抗原(SCVme)遗传融合而制成，以轻松检测SARS。在这种制备中，具有高金结合亲和力的GBP结构域作为金表面的锚定部分，而SCVme结构域作为识别配体用于检测SCVme抗体。SPR分析表明，融合蛋白通过GBP简单而牢固地固定在金的表面，不需要复杂的表面化学修饰，为抗SCVme的诊断提供了一个独特的、高稳定性的传感平台。

图8. GBP-E-SCVme和Anti-SCVme在金微图形上连续结合的示意图。

IX 免疫传感分析

免疫分析是一种生物分析方法，其中分析物(即抗原)和抗体的相互作用是测量特定分析物的基础。在这一点上，免疫传感试验被指定为一种使用抗体或抗体部分来识别生物分子的分析方法。免疫传感分析中产生的信号与抗原-抗体结合事件的发生率直接相关。在这方面，应用于免疫检测传感过程中的标记应具有许多特点：化学稳定性、低成本、对结合性能的负面影响、可行性、安全性和适用的仪器。值得一提的是，免疫传感技术常用于各种病毒的高灵敏度检测，如SARS CoV-2、HIV、HBV和HCV等。

最近，有研究介绍了一种基于侧向流动免疫分析的便携式快速检测装置，它可以在15 min内同时检测感染患者血液中的SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体，可以区分不同疾病阶段的患者。侧向流动测试，也称为侧向流动免疫色谱分析，是一种简单直接的纸基设备，其设计目的是识别流体样本中客观分析物的存在，而不需要任何特定和过高的硬件。

另外，电化学免疫传感器具有灵敏度高、成本相对较低、使用方便、响应时间短和小型化的可能性等优点，已被认为是一种极具吸引力的选择。最近，一种新的基于电化学免疫传感器的间接竞争检测方法被引入到MERS-CoV病毒的检测中。该生物传感器是基于固定化的MERS-CoV蛋白与游离病毒之间的间接竞争，在由金纳米颗粒改变的碳电极(DEP)阵列上对样品(图9)添加的抗体进行固定数量的竞争。该免疫传感器是在DPE阵列上研制的，可以同时快速检测各种类型的冠状病毒。

图9. MERS-CoV免疫传感器的制备方案和识别过程。

该生物传感器包括在纳米金结构的DEP阵列电极上进行的竞争性免疫分析，以实现对各种冠状病毒的多重识别。

X 适配子(Apta)分析

Apta被归类为传感方法，是由三组科学家(Robertson和Joyce，Tuerk和Gold，以及Ellington和Szostak)同时推出的短链寡核苷酸(RNA或单链DNA)。使Apta分析独一无二的主要性质之一是它们非凡的亲和力，这是它们的灵活性和与靶结合时折叠的能力的结果。它们具有体积小、靶分子特异性高、体内外适用性好、生物相容性好、生产成本低、分子稳定性高、检测下限低等优点。尽管适配子具有优势和多功能性，但也有可能限制其用途的缺点；这些限制是对核酸酶降解敏感，不能与一些缺乏官能团的靶结合，与抗体的结合比靶分析物更强(对酶消化敏感)。

SARS-CoV核衣壳蛋白(N)是含量最丰富的结构蛋白，具有准确、灵敏地检测病毒的识别标志作用。筛选出一种高亲和力的RNA适配子，它能与N蛋白结合，解离常数为1.65 nM。结果表明，所选适配子可以选择性地鉴定在N蛋白的C区，具有很高的特异性。分离的核酸适体可以作为N蛋白分子的捕捉剂，用于制备基于核酸适体的化学发光免疫分析和纳米阵列核酸适体。所制备的核酸适体-抗体杂交免疫分析方法可检测低水平的N蛋白(2 pg mL⁻1)，具有较高的灵敏度和选择性。该适配子-抗体联合免疫分析法可用于SARS-CoV N蛋白的快速检测，具有较高的灵敏度。

N蛋白是早期检测SARS冠状病毒感染最重要的抗原之一。为快速诊断SARS冠状病毒N蛋白，设计了一种基于量子点(QDs)连接RNA适体平台的高灵敏度、高特异性光学生物传感器。量子点是半导体材料中的一种胶体纳米材料，与传统的荧光团相比，量子点具有荧光寿命长、稳定性高、发射光谱可调等独特的光学性质，在纳米医学领域，尤其是成像系统中引起了极大的关注。为此，固定在玻片表面的SARS-CoV N蛋白可以有效地与量子点偶联RNA适配子杂交，产生荧光信号。荧光信号的强度与SARS N蛋白的浓度有关。这种基于光学量子点-RNA适体芯片的小型化装置可以检测浓度低至0.1 pg mL-1的SARS-CoV N蛋白。该图形化SARS-CoV N蛋白检测方法具有灵敏度高、准确度高、简便易行等优点。

总结与展望

目前，由于缺乏任何快速、可用和可靠的检测方法，导致新冠肺炎传播成为一个可怕的全球性危机。本文介绍了各种类型冠状病毒的几种重要检测方法，包括临床检测方法和基于传感器的检测方法：

1）以免疫分析为基础的方法，如ELISA，是检测各种病毒来源的抗原或其相应抗体的常用方法，用于诊断疾病或确定疫苗接种的效率。但SARS-CoV-2 IgG/IgM的敏感性仍有待研究。结果受阻是严重的问题之一，可能是由于一系列问题(假阴性、噪音、非特异性反应)造成的。一般来说，ELISA试剂盒价格昂贵，需要熟练的人员进行操作使用设备、解释和报告结果。这些挑战需要开发其他方法来克服这些问题。

2）免疫-聚合酶链反应(IPCR)是一种既利用抗体-抗原的特异性又利用PCR的敏感性的方法。ELISA的灵敏度不足以鉴定低抗体的病毒蛋白，它可以检测任何蛋白，PCR不利用抗体，不能直接用于病毒蛋白的检测。IPCR可重复检测，可提高从血清/尿液中检测皮飞克分析物的灵敏度(10到1000倍)，同时由于ELISA和PCR组合(通过抗体-寡核苷酸结合物)提供了多重选择。

3）病毒的精细检测和计数是由一种名为实时RT-PCR的优秀工具完成的，其中通过使用SYBR Green或许多荧光探针化学试剂对每个周期产生的改进产物进行定量，以诊断SARS-CoV-2；尽管RT-qPCR具有特异性，但由于漏诊的严重后果，其假阴性率不容忽视。

4）在分子方法和PCR或病毒疾病识别之间研究的其他方法中，基于LAMP的方法因其众多优点而具有重要意义。LAMP检测最显著的优点是使用较少的设备、可用、廉价、快速检测以及技术上可靠的测试但LAMP反应的假阳性还需要进一步研究。

5）CT扫描和RT-qPCR对SARS-CoV-2的诊断有重要意义；大多数临床医生建议CT扫描应作为一种必要的辅助诊断方法。由于RT-qPCR筛查阴性、临床怀疑感染的患者比RT-qPCR更敏感，因此反复RT-qPCR检测与胸部CT扫描相结合可能是有帮助的。

6）基于免疫传感器的技术的设计和使用完全是为了消除旧的临床方法的缺点，因此具有重要的意义。它们具有几个优点，包括快速检测、低成本、可获得性以及能够检测所需材料的低浓度。这些技术也适用于检测冠状病毒颗粒的几个部分，可以解决冠状病毒变异和假阴性结果的问题。LFA(侧向流动分析)是一种更重要、更有吸引力的检测设备，具有广泛的应用前景。它们能提供的重要好处是测试过程简单，样品量要求低，分析速度快，不需要专家人员，性能成本低，使用方便，而且性价比高。

7）简而言之，开发具有这些特征的医疗点生物传感器和纳米传感器可以提供在人群中快速筛查SARS-COV2病毒的机会，并限制病毒的传播。