2020药典 |《9306 遗传毒性杂质控制指导原则》解读与对策

不同的药物的生产工艺决定了来源各异、种类众多的杂质类型。杂质的成份复杂且含量较低，难以检测。然而，药品的安全关系到千千万万人的生命安全，必须制定严格的要求来控制药品的质量。

相关政策

为控制药物中遗传毒性杂质潜在的致癌风险，2020版中国药典四部通则部分，添加了《9306 遗传毒性杂质控制指导原则》。这个新的指导原则为药品标准制修订、上市药品安全性再评估提供参考。

药物杂质包括有机杂质、无机杂质以及残留溶剂等等。其中，2006年提出的基因毒性杂质是近两年关注的热门。该杂质又叫遗传毒性杂质（genotoxic impurities, GTIs），是指能引起遗传毒性的杂质。包括直接或间接损伤细胞DNA产生致突变和致癌作用的物质，也包括其他类型无致突变性杂质。

EMEA和FDA发布了相应的指南。2007年欧洲药品局EMEA实施了关于基因毒性杂质的解决方案。2008美国FDA发布了《Guidance for industry—Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substances and Products: Recommended Approaches》

对于未知数据的基因毒性杂质，制定了相关摄入阈值TCC（Threshold of Toxicological Concern，毒性物质限量），也叫做毒理学关注阈值。其意义在于最大程度上保证服药的安全，使致突变的风险低于相关限度。TTC的限度为1.5 μg/d。

基因毒性杂质来源与分类

基因毒性杂质可能产生的环节包括：1）新药合成；2）原料纯化；3）存储运输（与包装物接触）等。其主要来源有：原料药合成过程中的起始物料、中间体、试剂、反应副产物；药物在合成、储存或者制剂过程中的降解产物；部分药物通过激活正常细胞而产生基因毒性物质。常见类型有卤代烷烃、磺酸酯/烷基磺酸酯/芳基磺酸酯、氮亚硝胺类化合物、硫酸二甲酯和硫酸二乙酯、双烷基硫酸酯、氨基甲酸乙酯、环氧化合物、四甲基哌啶氧化物、肼类、芳香胺、硼酸以及乙酰胺等，在列表中的种类有1,574种。这些结构在药物中就是“警示结构”。（如下图）

化药中基因毒性杂质的案例有很多报道，比如沙坦类药物中的叠氮化物、亚硝胺类化合物，美罗培南中的318BP、M9、S5，抗艾滋药物Viracept (nelfinavir mesylate)中的甲基磺酸乙酯，以及阿瑞匹坦中的对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸异丙酯等等。

基因毒性作用原理

根据Miller理论，基因毒性试剂是亲电试剂或者可以代谢成亲电试剂，与DNA上的亲核基团反应生造成基因毒性。

酰基卤化物：由于卤原子电负性较大，吸引电子，导致羰基碳非常缺电子，一旦和DNA接触，会和腺嘌呤的羰基氧发生酯化反应。二甲氨基甲酰氯和二乙氨基甲酰氯被IARC归为致癌物2A类。

甲醛：高活性致癌物，与DNA发生多种反应。

卤代脂肪族类：毒性取决于卤素的性质、数量和位置以及化合物的分子大小。

一卤甲烷的肝脏代谢的第一步是与谷胱甘肽(GSH)结合，导致S-甲基谷胱甘肽的形成。最终可能转化为甲硫醇（有毒的代谢物）。甲醛产生也可能导致细胞损伤。甲醛来源于细胞色素P450直接氧化母体化合物或甲硫醇的代谢。

二卤代烷烃通常通过谷胱甘肽或者细胞色素P450代谢后活化，产生遗传毒性。

三卤代烷烃容易被P450氧化活化，产生光气，光气是一种高活性的亲电中间体。完全卤代烷烃倾向于自由基机理反应。

四氯化碳在P450中被还原成三氯甲基自由基，该自由基和DNA之间的加合物是导致肝癌的主要原因。

亚硝酸烷基酯亚硝酸酯：亚硝酸酯和DNA上的氮发生酯交换反应。

α，β-不饱和羰基：活泼的迈克尔受体，容易被亲核试剂进攻β碳或者羰基碳。

醌：亲核剂的烷基化。易于被亲核试剂进攻，可以和蛋白质上GSH、半胱氨酸烷基化。氧化还原反应。它们可以与相应的半醌自由基进行酶促(即细胞色素P450/P450还原酶)和非酶氧化还原循环，导致ROS的形成，包括超氧阴离子，过氧化氢，并最终形成羟基自由基。ROS是造成衰老和癌变的主要元凶。

烷基化间接作用试剂：单卤代烯烃卤代烯烃经过P450代谢后会被氧化成环氧化合物，然和和DNA反应诱导癌变。多卤代烯烃的反应更为复杂，三氯代乙烯进过P450代谢可以生成酰氯、环氧、氯代醛，这些物质均会诱导癌变。

肼类：该类物质通过P450中氧化酶的催化，肼被氧化成偶氮类化合物。然后反应生成一系列碳正离子、自由基等活性物质，最终导致DNA烷基化，诱导癌变。脂肪族偶氮化合物该系列化合物是肼的氧化中间体。

N-亚硝胺化合物：一类非常稳定的化学致癌物。代谢得到活性烷基和大分子（DNA或者蛋白质）烷基化是产生遗传毒性和致癌性的主要原因。得到的小分子醛会进一步和DNA结合造成额外的损伤。NDMA在缬沙坦中的限度被要求限制到＜0.3 ppm。

芳香胺：必须代谢为反应性亲电试剂，才发挥致癌作用。对于芳香胺和酰胺，这通常涉及N-羟基芳胺和N-羟基芳酰胺的初始N-氧化。这是由细胞色素P450介导的。在通过酶的酯化作用进一步活化，形成活性亲电物种。最终造成DNA损伤。

检测方案

对于基因毒性杂质，只有高灵敏度、高选择性的分析方法才能为更好地选择和建立基因毒性杂质的检测方法提供重要参考。分析方法包括GC、LC、GC-MS和LC-MS法等，还有相关的前处理技术包括顶空分析法、固相萃取法和衍生化法等。下图所示为，不同的基因毒性杂质的检测策略。

表1 不同类型杂质的检测方法和前处理办法

表2 常用分析方法的特点

具体解决方案【附连接】

（杂质：卤代烷）

【Agilent GC-MS】N,N-二甲基-3-氯丙胺盐酸盐（1,3-溴氯丙烷）
                      Intuvo 9000 气相色谱系统+5977B单四极杆质谱检测器

（杂质：N-亚硝基二甲胺，NDMA）

【Thermo】缬沙坦及雷尼替丁

【岛津】氯沙坦： LCMS-8050 高效液相色谱-三重四极杆质谱

【WATERS】缬沙坦——UPLC I-Class,Xevo TQ-S micro

（杂质：环氧化物/醚）

【Thermo】盐酸普萘洛尔：高分辨液质Q Exactive Focus+ESI和APCI

（杂质：磺酸类、磺酸酯、氨基酯类）

【Thermo】Triplus 300 顶空自动进样器+1300GC+ISQ-MS

【SHIMADZU】维格列汀：GCMS-TQ8050 NX

【SHIMADZU】酸肌酸钠

【WATERS】——Waters Xevo TQD 三重四极杆质谱：快速正负切换的模式

【Gs-Tek】(毛细管柱)气相柱GSBP-INOWAX 30m-0.25mm-0.25um液体直接进样法

（杂质：4-硝基卞醇）

【Thermo】 TSQ 8000 Evo+Unknown Screening 插件

（杂质：氯苯胺）

【SHIMADZU】

（杂质：丁酸氯甲酯和2,3-二氯苯甲醛）

【SHIMADZU】丁酸氯维地平

（文中图片来自文献：汪生, 杭太俊. 药物中基因毒性杂质检测策略的研究[J]. 中国新药杂志, 2019(23).）

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