浅谈影响数码显微镜分辨率的两大因素

数码显微镜是在传统显微镜上增加了数字图像传感器CCD或CMOS的显微镜，与计算机、图像处理、自动化、互联网等技术相结合，可衍生出多种产品和应用，如自动显微镜、数码互动显微镜、数字切片扫描仪等，能给用户带来极大的便利，在教学、医疗、科研等领域得到广泛的应用。

作为传感器，人眼和数字图像传感器CCD/CMOS主要有两方面的不同：一是数字图像传感器是由很多离散的感光器件组成，用其作为传感器接收显微图像，实际上是一个数字化过程（也称为空间采样）需要满足采样定理即奈奎斯特定理，这样图像才能准确重建；二是数字图像传感器的响应波长与人眼不一样，所以会受光源光谱特性的影响。本文从空间采样率和光源这两方面来分析对数码显微图像分辨率的影响。

空间采样率对数码显微图像分辨率的影响

奈奎斯特采样定理是指将模拟信号转化为数字信号时，要求采样频率f_s要大于模拟信号中最高频率f_max的2倍,即f_s＞f_max才可以通过采样之后的数字信号准确地重建出模拟信号。对于显微图像的数字化，其最高频率就是由物镜的极限分辨率决定的，采样频率也称为空间采样率，一般实际应用时要求空间采样率为物镜的极限分辨率的2.8倍左右。

显微镜的极限分辨率r是由物镜的数值孔径NA和波长λ决定的，满足式①                    

因此波长越短，显微镜的极限分辨率越高。

空间采样率s的计算式②为

式中p为数字图像传感器像素的边长；β1为显微物镜的放大倍率；β2为摄像镜头的放大倍率。

因此改变摄像镜头的放大倍率，可以改变空间采样率。选用一组不同放大倍率的摄像镜头实现不同的空间采样率，以研究空间采样率对数码图像分辨率的影响。具体实验条件如下：

显微镜：BA310显微镜。

光源：白光LED和卤素灯（可互换），带有550/20nm的干涉滤色片。

显微物镜：根据式①，其极限分辨率为0.45μm。

摄像头：CM3-U3-50S5M黑白摄像头，像素边长为3.45μm。

观察标本：采用USAF1951鉴别率板（如图1）所示，40×/0.75显微物镜可观察的极限线对数为2048（11-1组）。

图1 USAF1951鉴别率板

摄像镜头倍率：0.35×、0.5×、1×分别对应三种不同的采样率，采集的图像如图2所示，结果如表1所示。

图2 不同摄像镜头下的数码显微图像

表1 不同摄像镜头下的数码显微图像分辨率

由此可见，在没有满足采样定理的情况下即欠采样，数码显微图像分辨率会降低；在过采样的情况下，并不会带来数码显微图像分辨率的提升。

光源对数码显微图像分辨率的影响

式①提及的波长λ是最终被传感器接收的波长，此波长与传感器响应曲线和光源光谱特性有关。作为传感器，人眼的响应波长为400~700nm，即通常说的可见光，如图3所示。而对于数字图像传感器CCD/CMOS，其响应波长更宽，包括人眼不敏感的紫外和近红外部分，其中近红外的波长更长，如图4所示，这会导致显微镜分辨率的下降。因此当光源的光谱包含有人眼不敏感的近红外光谱或者紫外光谱时，在使用数字图像传感器时就会有影响。显微镜中常用的光源有白光LED和卤素灯，其中白光LED的光谱是450~700nm，如图5所示，与人眼的响应曲线比较接近，而卤素灯的光谱为400~2500nm如图6所示，包括了更长波长的红外部分。在分别使用卤素灯和白光LED时，由图像传感器得到的结果是有区别的，如图7所示。

图3 人眼的响应曲线

图4 相机的响应曲线

图5 LED光谱曲线 

图6 卤素灯光谱曲线

表2为不同光源下的数码显微图像分辨率，可以发现，人眼在不同光源下观察到的极限线对是一样的，都是2048线对，而对于数码显微图像，采用卤素灯时，观察到的分辨率会有所下降。主要原因在于卤素灯有红外光谱，人眼直接观察时会将红外部分滤掉，所以效果与LED相当，而数字图像传感器可以响应卤素灯的红外波长，所以分辨率会下降。解决办法就是数字传感器前放置一个红外滤色片（俗称IR-cut），将卤素灯的红外部分滤除，得到接近于人眼的响应曲线，这样就与目视观察结果一致。

图7 卤素灯和LED时的数码显微图像

表2 不同光源下人眼观察与数码显微图像分辨率的比较

因此在使用数码显微镜时，应严格遵从采样定理，并深入研究数码显微镜各个关键部件，这样才能选择合适的摄像镜头、光源、滤色片等，才能满足采样定理，准确重建出数字图像，达到最佳的观察效果。

本文摘自：陈木旺. 浅析数码显微镜分辨率的影响因素[J]. 光学仪器, 2017, 40(3).

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