从活脑中提取神经递质- HPLC-MS / MS方法

神经递质，大脑中在突触传递中担当“信使”的特定化学物质，称作神经递质，简称递质。图1、图2为其示意图。随着神经生物学的发展，陆续在神经系统中发现了大量神经活性物质。在中枢神经系统（CNS）中，突触传递最重要的方式是神经化学传递。神经递质由突触前膜释放后立即与相应的突触后膜受体结合，产生突触去极化电位或超极化电位，导致突触后神经兴奋性升高或降低。神经递质组成复杂，包括多种生化物质。

图1 神经递质示意图

图2 大脑中的“神经递质”，黑质就被称为“神经递质”

要对神经递质进行分析，必须首先从活脑中提取神经递质，然后用HPLC-MS / MS进行分析，这实在有点匪夷所思，令人难以置信。然而，加拿大滑铁卢大学雅努什·波利西恩（Janusz Pawliszyn）领导的团队成功了。

从活脑中提取神经递质，本质上是侵入性的。但是，他们通过利用固相微萃取（SPME）技术，已设法使其成为非侵入性的。他们的方法是将涂有某种形式的吸收性SPME材料的细不锈钢丝插入活体的大脑中。由于钢丝较细，对大脑造成的干扰较小，雅努什的团队使用150μm粗的不锈钢丝。他们首先用酸蚀刻了不锈钢丝的下端部分，直到它只有100μm粗。然后，他们将SPME涂在蚀刻部分，将其直径又增加至150μm。最后，又在涂层部分再添加了50μm厚的覆盖层。

该团队在特制的神经递质混合物（包括去甲肾上腺素，乙酰胆碱和5-羟色胺）上测试了各种不同的市售聚合物SPME材料，但没有一种被证明是理想的。问题在于性能最好的SPME材料是以相对较大的颗粒形式出现的，尺寸可达60μm，需要将其研磨成细粉末涂在钢丝上。但这种研磨导致材料失去了一些官能团，使其在吸收神经递质方面的效率降低。

所以波利西恩和他的团队选择使用来自沃特世的一种名为HLB（亲水 - 亲脂平衡）的SPME材料，这种材料在吸收神经递质方面不如其他一些材料有效，但其颗粒直径却只有5μm，可直接应用于钢丝。然后，他们在颗粒表面添加了强阳离子交换（SCX）基团，提高了材料对神经递质的有效性。在吸收神经递质混合物方面时，HLB-SCX材料被证明优于任何其他测试的SPME材料。

SPME材料确定后，他们用提取的脑组织和琼脂凝胶的混合物制成了人造大脑材料，以方便研究。在人造大脑材料中，加入了另一种神经递质混合物。他们发现，将HLB-SCX涂层的钢丝插入人造大脑，20min后，足以使HLB-SCX材料吸收令人满意的神经递质。将HLB-SCX涂层的钢丝取出，浸泡在水、乙腈和甲醇的混合物中，释放神经递质，然后以高效液相色谱 - 串联质谱（HPLC-MS / MS）仪进行分析。

实验表明HLB-SCX材料可以从脑材料中提取几种加标的神经递质，包括去甲肾上腺素、乙酰胆碱和5-羟色胺，用于通过HPLC-MS / MS在低于生理水平进行鉴定。然而，其他神经递质，包括牛磺酸，谷氨酸和γ-氨基丁酸，只能在高于正常生理水平的浓度下检测到。

最后，他们在活恒河猴猕猴的大脑上测试了他们的SPME方法。这包括在三个不同的场合同时将HLB-SCX涂层的钢丝插入猴脑的三个不同区域。当科学家用HPLC-MS / MS分析提取的物质时，能够检测到多种不同的神经递质，包括多巴胺、谷氨酸和色氨酸。他们用人工脑材料进行测试，甚至能够检测到牛磺酸，这是用生理检测方法检测不到的。他们还测量了大脑不同区域的不同浓度的神经递质，其中，在某区域发现的神经递质，在其它区域可能根本没有发现，即使在同一区域内，场合不同其神经递质也不同。

在此成功之后，波利西恩及其团队正在计划使用他们的SPME方法对活恒河猴猕猴大脑中神经递质的分布进行详细研究。他们还在考虑进一步提高方法提取效率的方法，以便它可以解释可能存在的所有神经递质。

（编译：符斌 北京中实国金国际实验室能力验证研究中心研究员）

根据Brain extraction: A novel method for extracting neurotransmitters from live brains编写

Published: Apr 15, 2019

Author: Jon Evans

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