数字PCR将给分子诊断市场带来什么?

　　写在首个数字PCR平台获批美国FDA之际。

本文作者为伯乐生命医学大中华区LSG产品经理赵云。

　　赵云 伯乐生命医学大中华区LSG产品经理

　　2019年2月14日，Bio-Rad 公司的QXDx AutoDG ddPCR系统及QXDx BCR-ABL%IS 试剂盒成为业内第一个获得美国食品和药物管理局(FDA)批准的数字PCR产品，510 (K) Number: K181661。这也使得Bio-Rad的微滴式数字PCR(ddPCR)技术平台成为业内目前唯一同时获得欧洲CE-IVD和美国FDA许可的数字PCR设备；如果继续获得中国NMPA的三类医疗器械注册，那么Bio-Rad的ddPCR技术设备将可以率先叩开全球主要国家和地区IVD市场的大门。据悉Bio-Rad QX200 ddPCR平台在中国的IVD注册工作也已处于临床试验阶段。

Bio-Rad QXDx AutoDG ddPCR系统

　　数字PCR是核酸定量检测方法的巨大飞跃

　　数字PCR沿袭了qPCR荧光化学原理，但数字PCR对靶标核酸的定量却采用了完全不用的数学原理和方技术方法。其核心思想是使样本中的核酸分子在若干独立微反应单元中随机分装和扩增，在PCR反应的终点进行各反应单元的荧光信号检测，没有qPCR那样的实时荧光信号读取的过程。方法学的本质差异使得数字PCR具有更高灵敏度、重复和可靠性，而且摒弃了对外部参照和标准参考物质的依赖。

　　毫无疑问，数字PCR是核酸定量检测方法上的巨大飞跃。但曾几何时，理念的过于超前、操作太过繁杂、使用成本高，让数字 PCR 在发展的道路上一度踯躅不前。直至新技术新思路的提出，特别是乳液PCR和微流控技术的融入，才使得数字 PCR 完成了从概念到成熟技术平台的转化，并成功实现商业化。而这其中，Bio-Rad 微滴式数字PCR无疑是行业翘楚。

　　肿瘤液体活检是精准医疗发展的必然选择

　　可以这样说，ddPCR的临床应用价值也是伴随肿瘤精准医疗理念的提出以及在医学实践中推行的过程中逐渐被认知的。

　　当前的医学实践中，对大多数实体肿瘤遗传状态的分析是建立在侵入性手段获取的肿瘤组织样本上。由于取样方式的伤害性，或者晚期癌症病人的状态不佳，又或某些癌症的特殊性，使得组织样本并不总是可以获得的样本，连续获取组织样本更加不切实际。

　　然而精准医疗方案的制定和调整必须了解肿瘤遗传状态的动态变化，又需要对病人重复取样。因此肿瘤的液体活检应运而生，成为临床中精准医疗发展的必然选择，并且成为行业的一次重要技术和理念的升级。而ddPCR的推出，应该说恰逢其时。

　　这是因为液体活检本质上是为了解决两个问题：样本来源和检测手段的问题。液体活检采用非侵入式方法获得血液及其他体液样本，可供检测的肿瘤来源的分子标志物包括ctDNA、cfRNA、非编码RNA、外泌体等，尤其是以ctDNA为样本对肿瘤相关的CNV/SNV、indel、表观遗传标志物进行分析，在当前的临床实践中得到推行。

　　然而ctDNA丰度低，且样本中还存在高丰度的野生型背景干扰，要稳定可靠地检出微小序列变异，谈何容易? 因此，稳定可靠地施行基于ctDNA的液体活检，对检测手段的灵敏度和准确性提出了更高的要求。

　　定性到定量——肿瘤检测的发展路径

　　尽管qPCR已在IVD领域得到了非常广泛应用，然而在液体活检方面，基于qPCR的COBAS、ARMS以及Super-ARMS的检测灵敏度却要低于ddPCR。有国内外的系统研究表明，对于血浆中的EGFR T790M突变的检测，ddPCR相比qPCR方法有更高的灵敏度^[1,2,3],有助于筛选出更多可能受益的病人。理论上，ddPCR可以稳定实现0.1%-0.001%的检测灵敏度，这很大程度上有赖于可用于检测分析的临床样本的量。举例来说，如果能获得100ng cfDNA，理论上ddPCR可稳定达到0.01%的检测灵敏度。

　　ddPCR的另一个优势就是对肿瘤标志物的绝对定量以及更好的数据重复性和再现性。这对于监测标志物的动态变化，为疗效的评估以及疾病进展的预测提供量化的数据意义重大。此外，对于提示耐药的标志物的定量检测(丰度百分比)，也有助于进一步筛选出含有低丰度耐药突变，仍可受益于治疗的病人，而不是简单的以阳性或阴性进行判断。

　　相信肿瘤标志物的检测会有一个从静态到动态，从定性到定量的发展过程。

　　总的来说，基于ddPCR的液体活检，可克服肿瘤组织异质性对肿瘤进行分子分型，还可对疾病进展进行预测，实现疗效实时监测和评估，还包括对微小残留病检测。ddPCR对于已知用药意义的肿瘤分子标志物的准确定量检测，为肿瘤的精准医疗提供信息和依据，参与肿瘤病人的全程管理。

　　ddPCR技术趋于成熟，临床应用已完成起步

　　在笔者看来，qPCR已经是非常成熟的技术，而ddPCR正处于快速增长的起步阶段。从技术的视角上看，ddPCR在液体活检的应用已经基本完成了起步，现在已经进入到接受市场和临床实践的冷静思考和评判期，而这应该被看作是ddPCR技术趋于成熟的表现，或者说是ddPCR走向成熟的必经阶段。

产品生命周期

　　ddPCR未来需要开展的工作，一方面是基于ddPCR的液体活检流程的统一化、规范化和标准化，以及在临床应用准入资格的获得；另一方面，在科学严谨的临床研究基础上，确认基于ddPCR的检测方法在不同IVD细分领域下的的临床有效性、实用性；同时更多的临床诊断试剂盒的厂家的积极介入，更快的推动ddPCR应用的深度和广度上的发展。

　　事实上自商业化以来，数字PCR技术特别微滴式数字PCR技术获得了快速发展。按照Markets and Markets的分析预测，全球qPCR和dPCR市场的年复合增长率有望将达到8.9%，到2022年达到5.31亿美元的市场容量，并且预计dPCR的增长将超过qPCR。尽管数字PCR的市场开发任重道远，但FDA的批准，无疑是ddPCR技术加快进入临床应用的重要起点，也是数字PCR行业快速发展的重要切入点。

参考资料

　　1. Wenxian Wang, Zhengbo Song, and Yiping Zhang. A Comparison of ddPCR and ARMS for detecting EGFR T790M status in ctDNA from advanced NSCLC patients with acquired EGFR‐TKI resistance. Cancer Med. 2017 Jan; 6(1): 154–162.

　　2. Buder, A., Setinek, U., Hochmair, M.J. et al. Targ Oncol (2019). https://doi.org/10.1007/s11523-019-00623-x.

　　3. 曹紫阳，吴伟，侯立坤，张伟，高彩霞，武春燕，张莉萍。微滴数字PCR与Super-ARMS PCR检测非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂治疗耐药后血浆游离DNA EGFR 基因T790M突变的对比分析。中华病理学杂志 2018年12月第47卷第12期。

　　4. https://www.marketsandmarkets.com/PressReleases/digital-pcr.asp

　　注：

　　ddPCR平台目前在中国大陆仅限于科研使用，不作为临床诊断。

　　Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定区域的商标。