盘点：三代PCR仪原理及应用

前言

　　人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。

　　但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了。

　　1985年，美国科学家穆利斯在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR(聚合酶链式反应)技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术开始走进生命科学界，应用于各大小实验室，成为生命科学实验室不可或缺的技术手段和工具，极大地推动了生命科学的研究进展。穆利斯也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。

穆利斯

　　PCR是分子生物学研究极其重要的工具，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制，即人为创造核酸半保留复制条件，使目的DNA在细胞外完成扩增的过程，它可被看作是生物体外的特殊DNA复制。

　　根据PCR原理，商业公司在PCR仪的基础功能上不断进行创新和改进。至今，PCR仪已经更新至第三代技术。为方便读者朋友理解，本文将对三代PCR仪的原理、特点、主要厂商及产品、应用领域做一系统梳理。

第一代——标准PCR仪

标准PCR反应过程

　　标准PCR仪也叫做终点PCR仪，是指目的基因仅经过预变性、变性、退火、延伸阶段产生大量的核酸序列的PCR仪，PE-Cetus公司推出的世界上第一台PCR自动化热循环仪属于此种。根据PCR退火温度和扩增条件(细胞内/外)，标准PCR又可以分为三类：普通PCR、梯度PCR和原位PCR。

　　普通PCR仪：一般把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，称之为普通PCR仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。主要是用作简单的、对单一退火温度的目的基因的扩增。

　　主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。

　　梯度PCR仪：普通PCR仪衍生出的带梯度PCR功能的基因扩增仪。梯度PCR仪每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置，一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(通常12种温度梯度)。由于被扩增的DNA片段不同，其最佳退火温度也不同，通过梯度设置，可一次性筛选出最佳的退火温度。这样既可节省试验时间，提高实验效率，又能节约实验成本。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。

　　梯度PCR仪多应用于科研、教学机构。

　　原位PCR仪：是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物、DNA聚合酶、核苷酸等均可进进细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。

　　原位PCR仪对于在分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有着重要意义。

　　需要说明的是，以上三种类型PCR仪并非是对立的，许多普通PCR仪结合了以上两种或者两种以上功能。

　　市售标准PCR仪种类繁多，国内外公司都有相应产品，赛默飞旗下PCR仪占据国内生命科学实验室的半壁江山，其次分别是是伯乐、罗氏和艾本德。

此处列出部分在仪器信息网参展并且是仪器信息网新品或者仪器信息网“绿色仪器”的一代PCR仪。

Eppendorf Mastercycler X50 梯度 PCR 仪(绿色仪器)

　　艾本德此款PCR仪采用2D-梯度技术，能够同时优化退火与变性条件，升温速度高达10°C/s，10台仪器可直接并组成网，适用于高通量应用或者人员众多需求复杂的实验室。

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力康Trident 960基因扩增仪(新品)

　　此款基因扩增仪与今年5月上市，创新点在于它是多模块PCR仪，可同时运行三种控温程序; 界面采用安卓系统，操作体验大幅提升; 最大升温速率达到6℃/s。

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第二代——qPCR(实时定量PCR)

　　1996年Applied Biosystems(现被赛默飞收购)公司推出了实时荧光定量PCR(RTFQ PCR)技术，并发明了世界上第一台荧光定量PCR仪，开始了从定性到定量的跨越。

　　实时定量PCR仪是指在PCR反应体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料(SYBR Green等)或荧光标记的特异性的探针(TaqMan Probe等)，在普通PCR仪设计基础上增加荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统，形成了具有荧光定量PCR功能的仪器，通过对PCR过程中产生的荧光信号积累实时监测整个PCR过程，再结合相应的计算机软件对所获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品特定DNA片段的初始浓度。

　　目前根据荧光信号反应样品浓度主要有两种该方法：

　　1.Taqman探针法

探针两端分别为报告荧光基团R和荧光淬灭基团Q，当探针完整时，R发出的荧光被Q吸收，检测不到荧光信号。探针随机结合到DNA单链上，PCR扩增时，探针被水解，R与Q分离，R发出的荧光就会被检测到。每扩增一条DNA链都会生成一个荧光分子。

　　2. SYBR Green Ι染料法

SYBR Green Ι是一种只有在和双链DNA结合时才会发荧光的染料。在PCR变性时，无荧光产生，到了复性和延伸阶段则能检测到荧光信号。

　　实时荧光定量PCR仪主要应用于病原体检测、药物疗效考核、肿瘤基因检测、基因表达研究、转基因研究、单核苷酸多态性(SNP)及突变分析等细分研究方向，广泛应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业等研究领域。

　　目前市售qPCR仪种类繁多，伯乐、罗氏、赛默飞均推出系列定量PCR仪产品，国内生物公司也相继进入这一市场，并取得了不错的口碑，如博日、力康、福生生物等。

本篇列出部分在仪器信息网参展的新品qPCR仪：

鲁美科斯实时荧光定量PCR AriaDNA-4(新品)

　　鲁美科斯此款荧光定量PCR仪主要创新点如下： 1.采用专利冻干微芯片技术，实现超微量进样分析，和常规PCR试剂和样品大大减少，普通PCR15微升，LUMEX实时微芯片PCR进样量1-2微升，节省进样量和后续使用成本; 2.专利冻干微芯片技术，避免试剂冷链储存，动感试剂涂布在芯片上，可实现一次性检测多种DNA和RNA样品，实现常温储存运输。

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天隆科技Gentier 96E实时荧光定量PCR检测系统(优秀新品)

　　Gentier 96E实时荧光定量PCR检测系统是天隆科技最新一代、为满足高端用户的实验需求而量身定制。该款产品具有科学高效的温控系统与光电系统、强大易用的软件分析功能、人性化的操控方式、六通道同步检测等诸多优势，能够轻松实现下游多重基因检测、定量分析、SNP分析、HRM分析等应用。

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第三代——dPCR(数字PCR)

　　不同于qPCR 对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字 PCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。

　　数字PCR是一种基于PCR反应(聚合酶链反应)的单分子绝对定量技术。如图1，在数字PCR的过程中：(a) PCR反应体系(含有荧光染料或探针)被分割为数以万计的均一微液滴，(b) 其中部分微液滴内会含有一个或多个模板，(c) 将这些微液滴收集到试管内进行PCR反应，其中含有模板的微液滴会产生扩增产物，由此具有较强的荧光，成为阳性微液滴，(d) 在PCR反应完成后，依次对每个微液滴内的荧光进行检测，(e) 根据微液滴信号的峰值高度，绘制出微液滴荧光分布的散点图，(f) 通过合理的荧光分类阈值将微液滴内的荧光强度数字化，判断出其中具有较强荧光的阳性微液滴(图1f中绿色的数据点，称为“1”)和具有较弱荧光的阴性微液滴(图1f中蓝色的数据点，称为“0”)，并通过“1”和“0”的个数来实现绝对定量。因此，与实时定量PCR不同，数字PCR不需要使用标准曲线，即可直接对核酸拷贝数的绝对值进行定量。

数字PCR原理示意图

　　最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。

　　迄今为止，目前市面上常见的数字PCR仪器主要有两种，根据微反应的形成原理不同，主要分为 “芯片数字PCR”与“微滴数字PCR”两类。

　　1.芯片数字PCR

芯片数字PCR原理图

　　2.液滴数字PCR

微液滴数字PCR原理图

　　液滴数字PCR源于乳液PCR( emulsion PCR) 技术，即将DNA模板与连接引物的磁性微球以极低的浓度(比如单拷贝) 包裹于油水两相形成的纳升至皮升级液滴中进行 PCR 扩增，扩增后的产物富集在磁性微球上，收集破乳后进行测序。通过油水两相间隔得到的以液滴为单位的 PCR 反应体系，比微孔板和 IFC 系统更容易实现小体积和高通量，而且系统简单，成本低，因此成为理想的数字PCR技术平台。

　　数字PCR技术主要应用于不稳定性分析、肿瘤早期研究、产前诊断、致病微生物检测、癌症标志物稀有突变检测等研究领域，也用于验证NGS中的低频突变、 DNA甲基化检测、突变多重检测等方向。

　　基于数字PCR精准、灵敏、高效的应用场景，巨头公司(伯乐、罗氏和赛默飞)纷纷在这一领域布局，并相继推出数字PCR产品，许多国产数字PCR厂商如泛生子、顺德永诺生物、科维思、 诺禾致源、小海龟科技也争相进入市场，数字PCR大有可为。

　　本篇列出在仪器信息网参展的部分数字PCR仪产品：

伯乐QX200 微滴式数字PCR系统

　　Bio-Rad的技术主要来源于QuantaLife公司，QuantaLife 利用油包水微滴生成技术开发了微滴式数字PCR技术，这也是最早出现的相对成熟的数字PCR平台，在运行成本和实验结果稳定性方面都基本达到了商品化的标准。2011年，QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收购，其微滴式数字PCR仪产品更名为QX100型号仪继续在市场上销售，这个早期型号为dPCR概念的普及和应用领域的拓展发挥了重要作用。2013年该公司又推出了升级型号QX200。

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赛默飞QuantStudio 3D Digital PCR System

　　Applied Biosystems于2013年也推出了产品，Quant Studio 3D数字PCR系统。采用高密度的纳升流控芯片技术，样本均匀分配至20,000个单独的反应孔中。在整个工作流程中，样本之间保持完全隔离，可以有效地防止样品交叉污染，减少移液过程，简化操作步骤。同时芯片式设计避免了微滴式系统可能面临的管路堵塞问题。作为Applied Biosystems在OpenArray芯片平台之外推出的全新的芯片式数字PCR系统，值得一提的是，这个全新的系统在设计理念上综合考虑了系统稳定性与运行成本因素，直接反映了该系统“适合所有分子生物学实验室使用的数字PCR系统”的市场定位。2013年，Thermo Fisher收购Applied Biosystems。

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Naica crystal微滴数字PCR系统

　　NaicaTMcrystal 微滴数字PCR系统是法国Stilla公司开发的下一代核酸绝对定量技术。使用cutting-edge微流体创新型芯片——Sapphire芯片作为数字PCR过程的唯一耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中，可称作Crystal微滴。PCR扩增实验在芯片上实现。对微滴成像用以检测包含扩增片段的微滴。最后一步是对阳性微滴计数从而得到精准的核酸绝对数量。

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新羿TD-1 微滴式数字PCR系统

　　新羿TD-1微滴式数字PCR系统由Drop Maker 样本制备仪和 Chip Reader 生物芯片阅读仪及其他相关试剂耗材构成。Drop Maker 样本制备仪采用光、机、电一体化设计，配套具有自主知识产权的微流控芯片，可以将水相样本快速制备成纳升体积的液滴，液滴数与样本体积相关，30微升样本可制备约5万个液滴。液滴尺寸均一，并可在PCR扩增后保持稳定。

　　Chip Reader R1生物芯片阅读仪采用光、机、电一体化设计，及激光共聚焦原理，配套具有自主知识产权的微流控芯片，可以准确快速地定位、识别纳升体积微液滴，获取其荧光信号值。经过泊松统计分析，提供研究者所需的阳性、阴性液滴数绝对数值，从而推算出起始靶标核酸分子精确浓度。Chip Reader R1 生物芯片阅读仪兼容Taqman水解探针和EVAGreen检测。

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　　与传统定量 PCR 不同，数字 PCR 通过直接计数的方法，可以实现起始 DNA 模板的绝对定量但是，目前的数字 PCR 技术仍然存在一些不足，制约了该技术广泛应用。例如，数字 PCR 自身特点决定了其分析的样品通量很低，基本每块芯片上万个反应单元都是针对单一样本的分析。而荧光检测技术的局限性限制了多个芯片的同时检测，因此该技术目前在常规基因表达分析中不具备优势。此外，数字PCR技术的灵敏度(分辨率) 和准确性有待进一步提高和优化，在临床诊断中需要进行大量的比较和验证实验(对照传统方法) 。基于精密仪器和复杂芯片的数字 PCR 技术成本高昂，也是制约其广泛应用的一个原因。

小结

PCR技术已在生命学、医学诊断、遗传工程、法医学和考古学等领域广泛应用，在临床检验中的应用，对疾病的诊断提高到基因水平，众多的疑难病症得到及时确诊和有效的治疗。

　　对于不同的应用场景，三代PCR各有优势，但是可以看出，数字PCR具有绝对定量的优势，是未来临床标准化分子诊断的首选技术。

　　相信在未来的几年里将会不断有新的技术和产品出现，不断扩展其应用范围，使之成为新一代分子诊断工具。

附：仪器信息网PCR仪专场