2018电镜网络会60个在线提问与专家解答：看电镜当下需求与热点

　　仪器信息网讯 2018年7月24日-26日，仪器信息网组织举办了电子显微学网络会议(iCEM 2018)，并围绕广大用户感兴趣的技术领域组织报告，分设了电子显微学理论、技术及仪器进展、电子显微学仪器维护保养与制样技术、电子显微学仪器在材料科学领域的应用、电子显微学仪器在生命科学领域的应用4个主题专场。邀请到20位电子显微学仪器专家及厂商技术研究人员进行报告并与参会者进行在线互动沟通。会议报名人数突破2400人次，参会者突破1500人次。

    在线报告过程中，在线参会者积极互动，与报告专家就报告内容进行了一系列提问、交流互动。近日，仪器信息网论坛中，按报告顺序截取其中60个现场提问问题及对应专家解答并发帖互动，引起了网友广泛关注（帖子链接：https://bbs.instrument.com.cn/topic/6949688）。以下再次将60个现场提问问题及对应专家解答，罗列下来，共享读者，以期侧面看到当下电镜一线用户的需求，以及电镜技术需求的热点。

　　报告题目：基于电子显微的原位力学表征技术与仪器进展

    报告人：张跃飞（北京工业大学）

    报告直达链接：http://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/iCEM2018/#a7

　　(建议点击链接查看报告，结合报告查看问题、专家解答)

    提问交流：

　　1、 老师您好!微纳米尺度的力学实验能多大程度的代表整体样品的物理性能?谢谢

　　答：报告中提到，微纳尺度在电子显微镜当中，也不只是微纳尺度，而是跨尺度的连续表征。从透射电镜的原子尺度到扫描电镜的毫米尺度都可以进行力学性能表征。这样的话我们认为，只要把跨尺度的系列测试做完，应该和样品整体的物理和力学性能有相关性，是可以代表样品的整体性能。

　　2、 张老师，双金属片的拉伸是否有热的作用，对材料的变形影响大吗?

　　答：双金属片的拉伸一般加热到60-80度范围，对材料的变形影响不是很大。

　　3、 张老师好!请问拉伸台结合EBSD测试需要特殊样品台吗?电镜空间是否足够大?

　　答：需要。因为样品需要旋转70度，一般的处理方式是将样品和样品台同时旋转。

　　电镜空间越大越好

　　4、 张老师，您好!我想问下原位高温测试有什么相关技术手段吗?谢谢!

　　答：可以进行原位拉伸，也可以进行一些原位压缩的实验。

　　5、 张老师，您好普通的电镜如S-4800也可以配特殊原位夹具，开展力学性能原位测试?有商业化的夹具?

　　答：应该可以。

　　6、 张老师，请问材料力学性能变化和电子结构变化之间的关系能用原位力学透射电子显微学研究么?目前有研究么?

　　答：目前来说不能直接相关。因为电子结构变化大部分还是基于原理的计算。

    报告题目：激光扫描共聚焦显微镜相关技术应用与最新进展

　　报告人：何其华（北京大学医药卫生分析中心）

    报告直达链接：https://www.instrument.com.cn/webinar/video_104489.html

　　 提问交流：

　　1、 发射光谱与激光光谱有什么不同?

　　答：发射光谱：是指荧光物质被激发光激发之后，它自己的发射光有一个范围。

　　激光光谱：每个荧光物质有一个最佳的激收峰，但能够激发这个荧光物质发射出荧光也是有一个光谱的范围。

　　2、 老师，您好，虽然双光子增加了光穿透深度，活体小鼠的confocal测量还是必须把皮层剥离，是吧?

　　答：不需要。只需要开个颅窗，把骨头磨薄或者磨穿就可以。如果想做到皮层下更深度的成像，是可以在保持小鼠活着的状态下把皮层剥离，这也是个比较新的技术。

　　报告题目：透射电镜生物样品制备技术

    报告人：孙磊（中科院生物物理所）

    报告直达链接：https://www.instrument.com.cn/webinar/video_104490.html

　　提问交流：

　　1、 超薄切片能切多硬的物体?

　　答：在材料的这个电镜当中，可能会有一些非常硬的物体比较难切。对于生物样品来说呢，一般我们不会做很硬的物体，当然如果有一些那个组织非常硬，比如说昆虫的背板。对于比较硬的物体，像种子，都要进行前处理，很多组织要进行脱钙进行软化。如果过硬的话，不仅是超薄切片刀能不能切得问题，而是因为没有办法很好的渗透，没有办法较好的钻中包埋块?没有办法形成很好的切片，切得时候不容易形成切片，有可能变成粉末落下了。到底能切多硬的物体不确定，对于生物样品来说肯定是不行的，要进行前处理的，软化，以便做成完美的包埋块，然后去切。

　　2、 老师，请问如何得到完美的贴壁细胞的化学固定超薄切片啊，求详细步骤说明，谢谢

　　答：对于贴壁细胞，如果要看原始样子的话，一般做原位固定(也就是说不离心收集)，直接在原位对它进行固定、脱水等处理，最后原位固定之后形成一个薄层在这个上面直接做切片。

　　做切片细胞最好的是做高压冷冻，就是直接把它培养在高压冷冻需要的蓝宝石片上，之后进行高压冷冻的固定，后期进行冷冻替代的处理，这个是比较好的处理方法。

　　3、 老师您好，您PPT的冷冻替代图中显示是从-90℃开始的，请问样品从液氮温度直接转入到-90℃的替代过程中不会产生冰晶吗?

　　答：从-90℃开始，冷冻替代才开始，有机溶剂才开始发挥作用。

　　但是从之前液氮温度到-90℃这个温度的过程中，样品不是从液氮中拿出来，放到室温，再放入-90℃中，而是在液氮中转移到冷冻替代剂中的。当然在液氮(-196℃ )的冷冻中替代剂是固态，把样品放在冰上，设好温度，慢慢的升温到-90℃，一旦到-90℃，冷冻替代剂融化后样品就会掉到里边。因为对于细胞内的样品来说，重结晶的温度大概是在-70℃，所以不会产生冰晶。

　　4、老师，想问下样品形成冰晶怎么判断的，有哪些重要特征，谢谢

　　答：比较空，但又不像囊泡非常饱满圆润的空，而是那个结构有些皱，有些丝丝的东西。

　　5、老师，请问徕卡超薄切片机价值大约多少，谢谢

　　答：加起来大概是将近100万，但是我们这个是冷冻切片器，所以如果是常温应该没那么多钱，但是具体多少钱，要问一下这个销售人员。

　　6、老师，您好，请问组织块高压冷冻后经过离子减薄能转入透射电镜中吗?怎么转入呢

　　答：可以的，但这个技术正在研发中 。

　　目前我们也在做这方面的工作，现在很具体的手段我不能透露。但是每个实验室都会设计一些自己的方法，针对这些方法自己的一些工具等等，但是可以实现

　　7、动物样品与植物样品制样的注意点有什么不同?

　　答：对于一些常规的不涉及到特殊组织的动物样品来说，因为没有细胞壁所以制样时间相对短一些。植物样品由于细胞壁，每一步都相应的长，包括脱水、渗透。而且一般需要在旋转仪上不停的搅动以利于它的脱水和渗透。

　　此外，所用树脂不一样。动物样品倾向于用812树脂，因为它的切割性能很好，同时在电子的照射下，形变最小，好切好看。但是呢，812树脂的粘度较大，对于有细胞壁的植物样品来说，它的渗透没有那么好。所以植物样品一般用粘度更小的spurr树脂。

　　8、材料切片也是这样过程吗?

　　答：材料切片没有那么复杂，因为不存在脱水的过程。但是材料样品性质，软硬度不同，有时候会难切。但是方法很多。

　　9、您如何评价微波组织处理技术?

　　答：挺好的，对于比较难于渗透的样品，像线虫在没有高压冷冻前用微波组织处理技术，能够进行很好的渗透。 所以这个技术任然是很有用的技术。

　　只不过现在更多用高压冷冻技术。对于常温制备，这个技术还是很好的，但是程序要设好。

　　10、请问液氮冷冻的植物或生物样品，可以直接放进电镜中观察吗?

　　答：不能。

    报告题目：化学类样品制备及电镜观察

    报告人：关波（中科院化学所）

　　报告直达链接：https://www.instrument.com.cn/webinar/video_104491.html

    提问交流：

　　1、 请问液体导电胶是什么材料的?能简要介绍一下制样要点和适用范围吗?

　　答：导电胶是把导电的碳颗粒分散到溶剂(水中，有机溶剂通常是异丙醇)当中，制样要点是将导电胶涂在台子上，然后把样品颗粒放到导电胶上，在导电胶凝固的过程中，样品能陷入到导电胶中，增加导电性。

　　适用范围：导电性差的，块状的，大的颗粒，有磁性的

　　2、 关老师，您好，我想问一下扫描电镜制样的液体碳胶的选择，水溶剂的和有机溶剂(异丁醇)的使用有什么区别，如何选择?

　　答：水溶剂干燥的比较慢，有机溶剂更易挥发，会很快。

　　样品很大的适合用水作为溶剂，挥发的慢有时间陷入到导电胶中，包裹的好一点。但是也要看相容性。

　　需要注意的是：有的样品多孔，吸附性强，不宜使用液体导电胶

　　3、 分子筛的样品孔道结构表征都需要进行包埋切片么?

　　答：根据样品大小决定。有的样品很薄，就不需要包埋切片。有的样品很大就需要。

　　4、 关老师，能详细介绍一下蔗糖粘片的方法吗?

　　答：在冷冻的条件下，用捞片环在过饱和的蔗糖溶液蘸一下，之后直接粘在片上

　　5、 关老师，请问用金属环捞片时，金属环有材质要求吗?金属环中间是有支持膜还是就是一个中空的环?

　　答：中空膜 材质：铁丝，铂

　　6、 关老师 请问水凝胶样品如何在环境扫描电镜中观察?

　　答：冷冻环境中

　　7、 老师，请问液氮泥是指 在-210℃以下把液氮冻成固定?

　　答：将液氮抽真空，部分液氮会快速挥发带走热量，剩下的会凝固变成液氮泥。

　　8、 老师，油漆漆片可以直接在扫描电镜下观察吗?

　　答：问题说的不太清楚，不知道有没有干燥。如有挥发就要冷冻下观察，或者是用环境扫描。

　　报告题目：典型氧化物水分解材料微结构的透射电镜研究

　　报告人：黄荣（华东师范大学）

    报告直达链接：https://www.instrument.com.cn/webinar/video_104492.html

　　提问交流：

　　您好，请问BVO和WO的侧面低倍照片中，如何判断哪个是BVO、哪个是WO

　　根据衬度结合能谱分析可以判断。

　　1、 请问您的样品是如何制备的?是原位加热吗?是什么牌子的样品干呢?

　　答：常规的离子减薄，切割、研磨、抛光

　　2、 您好!请问您的HRTEM和Mapping是使用哪个型号的电镜?

　　答：2100F

　　3、 老师，您好，想问下WO3和BiVO4薄膜的TEM图，是观察的薄膜侧面吗，怎么制样的?

　　答：截面, 离子减薄法

　　4、 请问如何做氧含量的定量分析呢?

　　答：EELS

　　5、 老师您好，三价和4价Ti的近边结构有什么区别么?能量分辨率选多大的比较适合分析价态精细结构。

　　答：Ti4+是典型的四个峰，Ti3+两个主峰

　　报告题目：电子显微技术在催化剂及材料表征中的应用

　　报告人：黄文氢（中石化北京化工研究院）

    报告直达链接：https://www.instrument.com.cn/webinar/video_104494.html

　　提问交流：

　　1、 二氧化硅纳米颗粒可以通过表面修饰来改善颗粒溶解度吗?

　　答：不清楚用在哪个方面。报告中提到的是在二氧化硅颗粒上浸渍催化活性组分，比如银，这样可以增加银的分散度，另外由于二氧化硅是球形的，可以增加比表面积，从而提高催化活性。

　　2、使用催化剂不会影响材料本身结构么?

　　答：不会的

　　3、催化剂的活性表面积与比表面积的关系?

　　答：有一定的差距

　　报告题目：电子背散射衍射技术在材料研究中的应用

　　报告人：曾毅（中科院上海硅酸盐研究所）

    报告直达链接：https://www.instrument.com.cn/webinar/video_104495.html

　　提问交流：

　　1、曾老师，在EBSD中，不同晶相的含量定量是怎么计算的?需要特殊软件吗?

　　答：通过面积计算含量，不需要特殊软件，任何一个EBSD的软件都有。

　　2、 欧拉角转换密勒指数时。得到的指数(hkl)是归一化指数，怎么换算成素质的整数(HKL) (参考杨平老师 书)?

　　答：0.125 0.253 0.988 可以写成124

　　3、通过菊池带标定hkl, 有什么自动标定软件?

　　答：老师是用手工标定，倾向于用投票法来做。

　　4、老师EBSD通常制样比较困难，请问有啥制样技巧么?

　　答：制样困难在于要求表面要很光滑。离子束刻蚀技术是最好的手段。

　　对于不导电的样品，要进行镀膜的处理。

　　5、做EBSD很花时间吗?

　　答：一般取决于晶粒大小。如果晶粒大小是150nm，步长设成100个nm，需要8、9个小时;如果晶粒大小是几十个微米，步长设成30个微米，做同样的范围，就会节省很多时间。

　　6、请问曾老师，请问有哪些合适的EBSD线下软件可以用，谢谢。

　　答：每个公司都有自己的线下操作软件

　　7、还是不明白EBSD如何测图像?

　　答：电子束在每一个像素点都扫，每个像素点得到一个菊池花样。之后跟数据库的晶面夹角来比对，来标定每一个菊池晶面。确定晶面后，就能标定曲轴(晶带轴)，就能测出到底是哪个晶面平行于样品的xy平面，哪个晶向平行于x轴，就能想出一个立体的空间，这一点对应的单胞是怎样的空间分布。同样的取向对应同样的晶粒。

　　8、EBSD和电子衍射相比，能大范围给出晶体结构信息，还有什么优势呢?是不是数据分析比电子衍射要复杂?

　　答：优势是EBSD对取向特别敏感，0.1度的取向变化都检测出来。但是电子衍射不敏感，变几度只是衍射斑点的强度产生了变化。

　　报告题目：利用电子显微镜获取生物样品三维结构信息的主要方法

　　报告人：黄小俊（中科院生物物理所）

    报告直达链接：https://www.instrument.com.cn/webinar/video_104496.html

　　提问交流：

　　1、 老师您好，请问切片的保质期是多久?能达到几年麽?染色和未染色的切片保质期一样麽?如果不染色想去看电镜，可以麽?我做的化学固定的切片，特别容易褶皱，请问这是什么原因啊?

　　答：如果保存的好，避光干燥保存，几年没问题。需要防尘。

　　可以，但是衬度低。通常发表的文章，或者想看清某个部位，能染色还是要染色的。

　　可能由于切片块的软硬度跟样品不匹配，此外要考虑纯树脂的区域和样品的区域是否一致，如果不一致，也容易褶皱。

　　2、 老师，我们在取材的时候，实在很难达到1毫米立方大小，最好的情况也得2-3毫米，这会影响研究么?

　　答：不是很影响，只要采取合适的固定方法，如多聚甲醛、戊二醛可以深入到更深的地方进行固定。

　　3、 请问化学固定的切片能去做TEM tomography麽?谢谢

　　没问题。

　　4、 老师好，请问三维重构渲染是如何操作呢?利用了什么软件?切片厚度有没有一个极限值，最厚及最薄是多少?

　　答：最基础的是你要先勾勒出感兴趣的区域，定义不同的组别，给每个组别定义不同的颜色就叫渲染。

　　Amira常用。根据切片方法来说，像超薄切片机最薄30纳米以上，如果刮掉表面要片的话，厚度可以到十几个纳米，连续切片关注的是均匀。

　　5、 老师，您说的是不是冷冻切片无法用扫描电镜观察?

　　答：不能。因为只能看到一个轮廓，观察不到细节。

　　报告题目：电子显微镜在颅脑肿瘤诊断中的应用

　　报告人：孙异临（北京市神经外科研究所）

    报告直达链接：https://www.instrument.com.cn/webinar/video_104499.html

　  提问交流：

　　1、 孙老师，您好，我刚开始学习超微结多超微结构的照片信息量很大，经常无法全面分析其中的所有内容，比如电镜照片各不相同，如何全面的学习超微结构这门学科呢?谢谢!

　　答：如果做超微病理诊断的医生，需要有很全面的知识，组织学，解刨学，病理学的基础。

　　2、 老师您好，请问对于入门者来说，如何全面学习和掌握电镜超微结构这门学科呢?因为照片信息量太大，如何更好更准确分析呢?谢谢!

　　答：和第一个问题相像，要有基础医学的知识。

　　3、您好，孙老师，肿瘤的鉴别诊断有很多方法，光镜下无法区分，我们可以特染，那我们什么情况下使用电镜观察?

　　答：有些今天没有涉及到的一些工作，比如说肿瘤方面，神经内科，外周神经和肌肉方面的诊断工作，确实是光镜下边没法区分。比如说做免疫组织化学的研究没有很精确的抗体进行染色，就只能用电镜观察。

　　4、使用的什么电子显微镜观察的呢?

　　答：120kV的透射电镜。主要是研究超微结构，组织形态。

　　5、老师，您好，肿瘤的TEM样品制样，也是包埋，切片，染色等常规生物制样步骤吗?

　　答：对，注意取材及时，避免自溶。

　　6、样品需要冷冻么?

　　答：零上四度就可以了。用到的固定液，工具都要预冷，注意不能冻结。

　　7、脑组织特别容易溶解，活体灌注都较难保存超微结构，临床怎样尽可能保存好手术标本怎样，克服自溶的难题?

　　答：实验室的取材来自临床的手术，取出后立即放入固定液中。这样就保证超微结构不会发生变化。

　　8、老师，样品制备有什么宝贵经验么?

　　答：可以通过仪器信息网了解。

　　报告题目：冷冻电镜的过去、现在和未来

　　报告人：尹长城（北京大学医学部）

    报告直达链接：https://www.instrument.com.cn/webinar/video_104500.htm

　　提问交流：

　　1、 老师，您好，请教您一个基础问题，为什么不直接用很多照片直接三维重构，还要有傅里叶变换和逆傅里叶变换过程?

　　答：在冷冻电镜的情况下，由于它的背景是冰,元素是H,O，生物分子的元素是C,H,O,

　　两者相比，实际上元素组成都是H元素，衬度很差，也就是说在电镜图像上，很难直接看到生物分子的图像，因此得到三维结构，首先要进行图像处理，提高信噪比，这里要用到傅里叶变换和逆傅里叶变换。另外在三维重构里也要用到，电镜图像是三维物体的一个投影图像(也就是说三维图像压缩到二维平面上的一个叠加的图像)。得到三维结构需要数学处理，中央截面定理只有在傅里叶空间成立，在时空间(电镜图像)是不成立的。因此要进行傅里叶变换，再做逆傅里叶变换才能得到三维图像。

　　2、 Nova CTF是什么技术?

　　答：由于电镜照相的不完美性，透镜会对图像产生调制作用，从而改变衬度。衬度的改变和频率空间有关，有正有负，因此需要进行校正。很据不同高度进行CTF校正就是Nova CTF。

　　3、 有机高分子材料能用SPA分析方法分析吗?

　　答：这取决于有机高分子是不是均一的，即所有高分子都是同样的分子，大小是否足够的大，最小的分子是60kD。如果你的有机高分子可以形成聚积体，比如微团，如果大小均一的话，也可以用。

　　4、 冷冻固定/包埋的具体步骤能详细介绍下吗?谢谢!

　　答：纯化的分子放到电镜的铜网上，把样品滴加到铜网上，(铜网进行亲水处理)

　　液滴用滤纸进行吸附减薄至水膜刚好覆盖所研究的分子，之后铜网利用重力装置快速下到冷冻剂里边。

　　5、老师刚才说到的亲水处理怎么操作?适用于普通TEM的水溶剂的粉末样品吗?

　　答：利用装置使空气中的分子电离，之后打到电镜铜网膜的表面，把疏水的分子去除掉，同时带电的空气分子会附着在膜表面，由于带电，自然就变成亲水表面了。合适，只要样品是在水溶液中，电镜的载网都需要进行亲水处理。