《细胞》中国学者报道人源Dicer与Dicer-pre-miRNA复合体冷冻电镜结构

　　4月26日，清华大学生命学院、清华 - 北大生命科学联合中心、北京市结构生物学高精尖创新中心王宏伟教授研究组在《细胞》(Cell)期刊 发表了题为《人源核酸内切酶 Dicer 蛋白与 Dicer-pre-miRNA 复合体的冷冻电镜结构》(Cryo-EM structure of human Dicer and its complexes with a pre-miRNA substrate)的研究论文，首次报道了人源核酸内切酶 Dicer 蛋白的全长高分辨率结构，同时还报道了人源核酸内切酶 Dicer 蛋白结合一种小 RNA 前体 pre-let- 7 底物的两种不同结构状态。

　　RNA 干扰(RNAi, RNA interference)是敲低一个基因表达的最为常用的一种手段。内源性引起 RNA 干扰的小 RNA 主要是微小 RNA (miRNA)。 到目前为止，人体内已经发现多达 1800 种微小 RNA，越来越多的文献报道认为很多肿瘤的发生发展、转移等行为与微小 RNA 的异常表达密切相关。

　　人体内绝大部分微小 RNA 成熟形成都离不开一种核酸内切酶，我们称之为 Dicer 的蛋白。有趣的是人体内只有一个拷贝的核酸内切酶 Dicer 基因, 表达唯一的一种人源核酸内切酶 Dicer 蛋白，然而却负责人体内绝大部分微小 RNA 的形成。因此，核酸内切酶 Dicer 蛋白在人体细胞中的重要性不言而喻。核酸内切酶 Dicer 蛋白是一种只切割双链 RNA 底物的内切酶，分子量大小约为 220 kDa，有多个结构域组成。其中有的结构域负责结合 RNA 底物，有些结构域负责切割 RNA 底物，还有些结构域就像一把尺子，精确测量出 RNA 需要被切割的位置。人源核酸内切酶 Dicer 蛋白能够识别细胞内众多不同的微小 RNA 前体底物，然后加工生成具有共同特征的长度约为 22 碱基和 3'末端有两个游离碱基的成熟小 RNA。

　　遗憾的是, 人源核酸内切酶 Dicer 蛋白的整体三维结构一直没有得到解析， 人源核酸内切酶 Dicer 蛋白是如何精确加工这些微小 RNA 前体的机制至今仍然不清晰。人源核酸内切酶 Dicer 蛋白一直没有获得高分辨率三维结构的主要原因有几点：1、人源核酸内切酶 Dicer 蛋白约为 220 kDa，对于运用晶体学来获得三维结构来说，分子量比较大，很难结晶;2、对于运用单颗粒重构的方法来获得高分辨率三维结构来说，其分子量又相对较小;3、核酸内切酶 Dicer 蛋白三维结构呈 L 型，没有对称性，在冰中分布多为长条型，衬度低，分布不均匀，有优势取向，对单颗粒三维重构形成了很大的技术障碍。

　　过去十年的时间里，王宏伟以及其他课题组都尝试运用单颗粒电镜的方法去解析人源核酸内切酶 Dicer 蛋白的三维结构。经过不断地摸索，研究组解决了蛋白质样本准备、冷冻样本制备、数据收集及处理等多方面的技术难题，最终采用从哺乳动物 293F 细胞系中共表达蛋白复合体，亲和层析分离纯化蛋白质，采用纯金或者镀金载网制备出了分布较为均一、优势取向相对较少的冷冻电镜样品，并获得获得了人源 Dicer 及其辅因子蛋白 TRBP 复合体的高分辨率三维结构(4.4 埃)(图 1)，首次解析了人源核酸内切酶 Dicer 蛋白的高分辨率整体结构，看到了核酸内切酶 Dicer 蛋白中各结构域的精确三维分布及结构域之间的空间关系。

图 1. 冷冻电镜解析获得的人源 Dicer-TRBP 复合体 (TRBP 是一种 RNA 结合蛋白) 高分辨率结构及其结构域分布

　　为了更进一步了解人源核酸内切酶 Dicer 蛋白是怎样加工微小 RNA 前体的过程，王宏伟研究组通过体外重组的方法获得了人源 Dicer-TRBP 复合体与一种微小 RNA 的前体 pre-let- 7 所形成的三元复合体，并解析了该复合体的两种三维结构状态。一种是 pre-let- 7 的茎部呈完全互补结构(hDicer-TRBP-pre-let-7 complex class I)，另一种是 pre-let- 7 的茎部呈部分解离的状态(hDicer-TRBP-pre-let-7 complex class II)(图 2)。王宏伟研究组与清华大学张强锋研究组合作，通过化学修饰测序(icSHAPE)、核糖核酸酶酶切、测序胶电泳等技术，发现 pre-let- 7 在溶液中呈动态的构象平衡，一部分 pre-let- 7 的茎部是完全配对的双链螺旋结构，也有一部分 pre-let- 7 的茎部是呈部分解离的状态。深入的研究表明人源 Dicer 蛋白与 TRBP 形成的复合体与 pre-let- 7 结合可以促进该 RNA 向茎部完全配对的双链螺旋结构转换，确保其茎部在被 Dicer 蛋白切割前的构象均一性，从而保证微小 RNA 产物的精确长度。正是这个机制有可能保证了人源 Dicer 蛋白精确地将众多结构特征不同的微小 RNA 前体切割成具有共同的 22nt 长度的产物。这项工作为进一步解析微小 RNA 的成熟机制奠定了基础。

图 2. 两种 hDicer-TRBP-pre-let- 7 复合体的冷冻电镜结构

　　在本工作中，王宏伟研究组成员，清华大学生命学院博士后刘忠民、王家、2015 级博士生程航、2015 级博士生柯鑫为共同第一作者，王宏伟教授为本文的通讯作者。另外，清华大学生命学院张强锋教授，生命中心 2013 级孙磊博士开展了 icSHAPE 的实验，为本工作提供了重要的实验证据。本研究获得了清华大学冷冻电镜平台、高性能计算平台和蛋白质分离纯化与鉴定平台的支持，数据处理在国家蛋白质科学(北京)设施清华大学高性能计算平台上进行。

　　本工作获得了国家自然科学基金委、科技部、北京市科委、生命科学联合中心和北京市结构生物学高精尖创新中心等的大力支持。