Cell Research报道NgAgo“有效” 韩春雨实验仍不可重复

　　NgAgo 又搞事情了。

　　11月11日，Nature 旗下生命科学期刊 Cell Reseach在线刊登了中国南通大学神经再生重点实验室副教授刘东团队关于 NgAgo 研究的最新成果——他们发现 NgAgo 系统确实有效!在这篇题为 NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish的 Letter to the editor 中，研究者观察到，NgAgo 确实可以改变斑马鱼的表型，但这并非是通过基因编辑实现的。事实上，团队通过实验得出结论，NgAgo 系统可以在不改变目标基因序列的情况下，对基因表达实现 knockdown(即下调其目标 mRNA 表达水平)，且这可能与 NgAgo 的基因剪切活性没有关系。

　　文章作者同时强调，他们没有在斑马鱼中观察到 NgAgo 系统的基因编辑功能。

　　所以，曾经的“基因编辑工具”

　　真正作用是 knockdown ?!

　　我们这里先简单介绍一下以上的几个结论是怎么做出来的。

　　首先，NgAgo 可以改变斑马鱼的表型，但与基因编辑无关

　　研究者选择了斑马鱼中一个名叫 fabp11a 的基因作为 NgAgo 的“调控”对象。这个基因可以编码一种脂肪酸结合蛋白，可以调节葡萄糖及脂质的稳态，还有炎症反应。除了试试 NgAgo，研究者还想看看 fabp11a 在斑马鱼胚胎发育过程的作用，于是，他们将编码 NgAgo 的 mRNA 和设计好的 5’-磷酸化单链 DNA 一起注射到了单细胞时期的斑马鱼胚胎中。

　　为了确保注射的 NgAgo mRNA 能够进入细胞核表达 NgAgo 蛋白，研究者专门在 mRNA 的两端增加了细胞核的定位序列(NLS);而 5’-磷酸化单链 DNA 专门靶向 fabp11a 的第二和第三个外显子——如果 NgAgo 能编辑基因，这两段基因序列将会被改变。

是：NgAgo 的存在，使 30% 的斑马鱼胚胎在发育后出现了眼部畸形，但这不是基因编辑的结果(*3)!

　　测序发现，fabp11a 的基因没有发生任何变化，反倒是 fabp11a mRNA 的相对表达量下降了约50%。

　　fabp11a 没有被编辑，但被 knockdown 了。

　　其次，NgAgo 的 knockdown 作用在斑马鱼中存在普遍性。

　　NgAgo 对 fabp11a mRNA 表达的下调是一个意外吗?为了验证这一点，研究人员又对斑马鱼中的其他四个基因进行的测试，结果发现，在靶向 ta、kdrl、 lama1 和 flt1 这4个基因时，NgAgo 都能实现 knockdown 作用，并且改变基因所对应的表型。

　　NgAgo 的 knockdown 作用是具有普遍性的。

　　最后，作者没有在 NgAgo 中重复出基因编辑功能

　　河北科技大学教授韩春雨此前在《自然-生物技术》上发表的文章显示，NgAgo 系统可以在 37°C 的条件下对人细胞进行基因编辑，编辑效率为 11.2%-41.3%。研究者在确保半数以上的实验斑马鱼胚胎能正常发育的条件下，将实验温度设定为 37°C。然而结果显示，NgAgo 系统在这一条件下仍没有表现出任何基因编辑活性——尽管 knockdown 效应仍然存在。

　　有趣的是，当研究者将 NgAgo 中两个天冬氨酸位点进行突变 —— 有研究预测，这两个位点与 NgAgo 的基因剪切催化活性有关，并没有对实验中出现的 knockdown 效应产生影响。 这说明，研究者观察到的 knockdown 效应可能与NgAgo 的基因剪切活性没有关系。

　　最后，研究者以这样一句话结束了本篇文章：

　　??we hypothesize that gDNA/NgAgo may bind to a target gene to block its transcription. Overall, we suggest that the gDNA/NgAgo system provides an alternative strategy for gene knockdown in zebrafish.

　　我们提出一种假设，即 gDNA/NgAgo 的作用可能是结合目标基因，从而阻碍基因的转录。总的说来，我们认为 gDNA/NgAgo 为斑马鱼中的基因knockdown 提供了一种替代方案。

　　为斑马鱼中的基因 knockdown 提供了一种替代方案。

　　为基因 knockdown 提供了一种替代方案。