蛋白质印迹实验具体操作步骤

蛋白质印迹实验具体操作步骤

   蛋白质印迹免疫分析的过程包括蛋白质经凝胶电泳分离后，在电场作用下将凝胶上的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜上，经封闭后再用抗待检蛋白质的抗体 作为探针与之结合，经洗涤后，再将滤膜与二级试剂-放射性标记的或辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶 偶联抗免疫球蛋白抗体 结合，进一步洗涤后，通过放射自显影或原位酶反应来确定抗原-抗体-抗抗体复合物在滤膜上的位置和丰度。

    【蛋白质印迹实验所需试剂】

    1.IgG 标准品

    2.羊抗人辣根过氧化物酶（HRP）标记的IgG 抗体

    3.转移buffer:Tris 3.03g,Gly14.4g,甲醇200ml,加三蒸水至 1000ml充分溶解，4℃冰箱贮存。

    4.Tris buffer（TBS）：Tris 2.42g,NaCl 29.2g,溶于600ml三蒸水，再用1N HCl调至pH7.5,然后补加三蒸水至1000ml.

    5.漂洗液（TTBS）：TBS液500ml,加 Tween20 250ul.

    6.封闭液：5%脱脂奶粉。

    7.抗体buffer:1.5g BSA溶于50ml TTBS.

    8.显色液DAB（3.3-diaminobenzidine,3.3-二氨基联苯胺）配制：5mg DAB溶于10ml 柠檬酸buffer（0.01mol/L 柠檬酸2.6ml,0.02 mol/L Na2HPO4 17.39ml），加30% H2O2 10

    μl（临用时现配）。

    9.脱色液：甲醇250ml,冰醋酸100ml,加蒸馏 水至1000ml.

    10.氨基黑染色液（0.1%氨基黑 -10B）：0.2g 氨基黑-10B 溶于200ml 脱色液中，充分搅拌溶解，滤纸 过滤。

    【蛋白质印迹实验操作步骤】

    一、样品的SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳

    按实验四操作步骤进行。加样时，注意在同一块胶上按顺序做一份重复点样，以备电泳结束时，一份用于免疫鉴定，一份用于蛋白染色显带，以利相互对比，分析实验结果。

    二、转移印迹

    1.转移前准备：将滤纸，硝酸纤维素膜（NC）剪成与胶同样大小，NC膜浸入蒸馏 水中 10-20min 后浸入转移buffer中平衡30min .

    2.凝胶平衡：将电泳后的SDS -PAGE胶板置于转移buffer 中平衡 30-60min.

    3.按图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。

    4.开始转移，连接正负极，盖好盖子，接上电源，恒流 0.8mA/cm,室温下转移1h,转移后的凝胶再用氨基黑10B染色液染色20min ,然后脱色检测转移效果。

    三、免疫染色

    1.转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭，4℃过夜。

    2.TBS洗膜1-2次，10min/次。

    3.加HRP标记的抗体，室温1h .

    4.TBS 洗3次，10min/次。

    5.NC膜再转入DAB显色液中，置暗处反应，待显色反应达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应。