冷冻电镜的分辨率革命

　　精确认识细胞当中的大分子结构对于理解它们的功能至关重要。Amunts等人利用冷冻电镜获得线粒体核糖体大亚基3.2埃的分辨率结构，还有最近利用冷冻电镜获取的其他一些高分辨率结构，这些成就预示着分子生物学研究的新时代，获取近原子分辨率的大分子结构将不再是X射线晶体学和核磁共振的特权。

　　图：利用冷冻电镜获得的近原子分辨率结构：(A)酵母线粒体核糖体大亚基，分辨率3.2 埃。(B) TRPV1离子通道，分辨率3.4 埃。(C)F₄₂₀-还原[NiFe]氢化酶，分辨率3.36埃。注：该图并不是按比例绘制的。

　　核糖体是古老的，大规模的蛋白RNA复合物，它将线性遗传密码翻译成三维蛋白质。线粒体——半自主细胞器，为细胞提供能量，拥有它们自己的核糖体，这一点和细菌非常类似。许多抗生素，如红霉素，通过阻止细菌的核糖体翻译机器来抑制细菌的生长。当设计新的抗生素，不能让他们同时阻断线粒体核糖体很重要。因此，认识这两种核糖体的详细结构是很有价值的。其他核糖体的结构已经通过X射线晶体学确定。Amunts等利用冷冻电镜确定了线粒体核糖体的高分辨率结构，这在不到一年前，很少有人会想到可能实现。

　　不用晶体而能够做到这一点无异于是一场革命。主要是因为采用了新的探测器——具有前所未有的速度和灵敏度的直接电子探测器。直接电子探测器能够直接检测电子，而不是需要先将它们转换成光子，然后再转化为光电子探测进行，目前广泛使用的CCD(电荷耦合器件)相机就是这样，但它们的分辨率不是很好。照相胶片从工作原理上来说，高分辨率成像效果应该更好，但它很难和越来越重要的快速读出电子速度及高数据吞吐量相兼容。

　　大约10年前，Henderson和Faruqi意识到，应该有可能设计出一种结合了CCD相机和胶片优点的直接探测电子的传感器。他们和两个竞争团队研发的探测器，采用了和大多数手机中的摄像头芯片基本相同的有源像素传感器技术。然而，手机的芯片不能用于电子显微镜，因为强烈的电子束会瞬间破坏它们。因此，首先探测器必须能够抗辐射。第二，探测器所需的像素要大很多，以防止富含能量的电子一次激发多个像素。第三，摄像头采用的芯片必须非常薄，完成每次读出电子160万像素，否则电子散射将会使图像模糊并降低分辨率。目前传感器的厚度大约是一张纸厚度的一半。

　　冷冻电镜只需要少量的样品，因此那些无法分离得到大量样品，利用X射线晶体学方法进行分析的物质，现在可以利用冷冻电镜得到高分辨率结构。这同样适用于不容易结晶的非均相样品或柔性复合物，因为不同颗粒或构象的物质的冷冻电镜图像在图像处理阶段很容易分离开。

　　新的检测器提供了另一种决定性的优势：当电子束撞击薄的、不支持冷冻的样品时，它们的快速读出能够补偿小的不可避免地移动。在新的相机问世前，由于电子束诱导移动引起的模糊是一个看似不可逾越的问题。现在，通过快速连续拍摄，可以得到一个区域的数十张图像，并且电子束诱导移动被检测到并反转在电脑上。这种去除模糊的影响戏剧性的和天文学哈勃望远镜相类似，尽管在这两种情况下引起模糊的原因是不同的。

　　新的相机也促使了低温电子断层扫描成像的重大突破，低温电子断层扫描能够得到全细胞、细胞片、或细胞区室的三维图像，如线粒体。利用断层成像识别分子特征，采用标准CCD相机甚至已达到亚纳米细节，新的探测器问世也必然给断层成像研究带来巨大的变化。

　　在新相机问世的同时，强大的极大似然图像处理程序也被开发出来。这些程序定义可靠客观的标准，来对几万或几十万个的单粒子图像进行平均处理，为的是要实现高分辨率。先进的检测器和软件相结合，获取的冷冻电镜结构，在相同的标称分辨率下，其清晰度和map definition比采用X射线晶体学解析的结构要好，因为在冷冻电镜图像中包含着高质量的相位信息。

　　冷冻电镜的分辨率革命是否意味着X射线蛋白质晶体学时代即将结束?当然不是。在可预见的将来，分子量小于100kD的小蛋白，分辨率达到2 Å或更好将依然是X射线晶体学的领域。但是对于大的，易碎的，或者柔性结构蛋白(如膜蛋白复合物)，它们很难形成晶体，但却在生物医学中起着关键的作用，新技术将对此带来重大突破。在未来，对分子量大、已知的蛋白复合物，如核糖体，进行结晶将可能不再是必要的。相反，它们的结构可以从容并迅速的通过冷冻电镜来确定。这真是激动人心的时刻。（编译：秦丽娟）

    原文检索：http://www.sciencemag.org/content/343/6178/1443.short