HALO-2.7 HILIC技术特性

　　HILIC，也叫做亲水作用液相色谱，非常适合分离极性化合物。

图1反相色谱和HILIC的不同的选择性

　　Adenosine 腺嘌呤核苷 cytosine 胞嘧啶 acenaphthene 苊

　　保留机理

　　HILIC的保留机理还不是很清楚，但是似乎像是和亲水作用、离子交换以及反相保留的共同作用有关。在HILIC填料表面的极性表面上的水层促进了与极性化合物的作用。HILIC随着流动相变化的保留趋势和反相保留的相反，即是最强的流动相含有高比例的水而最弱的流动相含有高比例的有机溶剂。对于梯度分离，最初的流动相中含有高有机溶剂，通过增加水的含量来实现梯度。对酸碱化合物保留最强的是当流动相中有机溶剂(如乙腈)的含量超过70%的时候。由于流动相中含有高比例的有机溶剂，HILIC特别适合用于与MS联用。

　　由于HILIC模式使用高极性的流动相，所有的酸性和碱性化合物都能展现出非常对称的峰形，而且优于反相色谱。此外，HILIC柱具有有利于处理样品过载效应。尽管，在反相色谱中增加柱温可以改善柱效和峰形，但是HILIC柱的推荐最高使用温度不超过60 ℃。

　　流动相溶剂

　　乙腈是HLIIC常用的流动相组分。用这种溶剂，用的最多的含量是在60%-95%，至少要含有5%的极性较强的溶剂如水或者是甲醇。如果需要使用缓冲溶液，水将会有助于缓冲盐的溶解。和在反相色谱中一样，有机溶剂的种类可以改变样品的保留特性和分离选择性。在HILIC中溶剂的强度顺序(由弱到强)： 四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水。

　　当需要使用梯度洗脱来优化流动相的条件时，最初的溶剂组分建议含有90-95%的乙腈，最终的溶剂组分包含50-60%的乙腈。最终的洗脱特征可以用来推测等度洗脱合适的流动相的组成，这一点和反相色谱相似。如果要增加样品在 HILIC柱上的保留，将水用其他极性溶剂例如甲醇或者异丙醇替换往往有效。

　　流动相缓冲溶液

　　为了优化色谱柱的柱效和重复性，流动相可以包含10-20 mM 或者0.5%含量的缓冲溶液。由于其在高有机溶剂中难溶解而且和MS不兼容，所以不建议用磷酸盐缓冲溶液。在流动相中可以添加含量不超过1%的甲酸，三氟乙酸，磷酸等。当液相系统和MS联用时，20mM 挥发性的乙酸铵/甲酸，pH3.0缓冲溶液对于分离酸性化合物和碱性化合物往往很有效果。乙腈/甲酸流动相可以用于酸性化合物和碱性化合物液相色谱分离的起始流动相。浓度为5-20mM，pH 5左右的乙酸铵也可以使用，但是对于分离强酸碱化合物效果不是特别好。缓冲溶液或者是添加剂的pH值最好不要超过6，因为强碱性的条件会使得硅胶溶解。

　　样品条件

　　和反相色谱一样，样品溶剂在使用HILIC的时候条件也很重要。样品溶剂要尽可能和流动相的强度和种类相近。样品溶剂可以包含比流动相更高的有机溶剂，但是如果包含更高极性的溶剂(如水)，色谱峰(特别是早洗脱的峰)的形状将会受到影响。如果用流动相溶解效果不好时，则建议使用75：25(v/v)的乙腈/甲醇。特别强的溶剂，如二甲亚砜或者是DMF往往导致峰形不佳而不建议使用。在得到满意的峰形之前，这些溶剂一般用弱溶剂如乙腈等稀释使用。

　　HALO色谱柱技术咨询：

　　通微苏州分公司-苏州环球色谱有限责任公司 李静博士

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　　附录：HALO色谱柱及熔融核(核-壳)技术简介

　　熔融核技术是由杰克柯克兰(J.J.Kirkland)所发明的。柯克兰教授被公认为是HPLC的创建者之一，并且他的研究和贡献是被色谱界人士广泛认同的。他发表了超过150份主要研究文献和6本书籍。柯克兰博士还拥有30项专利，并且在色谱领域已经获得了很多著名奖项。

　　HALO柱填料不是按照常规方式制作的。相反,HALO UHPLC所填充的填料是利用Fused-core(熔融核/核壳)技术制备出来的，可以实现超快速色谱分离，同时避免了UHPLC的一些不足之处。

HALO熔融核颗粒

　　Fused-core 填料技术是由 Jack Kirkland 发明的，该类填料最初是为了使得UHPLC色谱柱比常规2μm填料UHPLC色谱柱更坚固可靠。正如它的名字一样，Fused-core 即是将多孔硅胶壳熔融到实心硅胶颗粒表面。

　　HALO色谱柱所产生的反压明显低于UHPLC色谱柱。这样的低反压可以使仪器承受压力降低，使操作起来更为方便。正是HALO柱适度的反压使得他们能用于常规的HPLC仪器却实现近似UHPLC的性能。此外，HALO色谱柱所用的筛板的孔径要远远大于UHPLC色谱柱(2 μm vs 0.5 μm)。这个更大的孔隙柱入口筛板减少了UHPLC柱入口筛板的堵塞问题。事实上,HALO柱的入口筛板不会比常规的填充5μm颗粒的柱子上的筛板小，不可思议吧。

　　“熔融核硅胶柱能减少扩散质路径，允许使用更短的柱子和较高的流速以达到明显的快速高分辨率分离。”

　　——Analytical chemistry，2007年8月