β2-受体激动剂是指含氮激素中的苯乙胺类药物(phenethylamines,PEAs)苯乙胺类药物具有苯乙醇胺结构母核,苯环上连接有碱性的β-羟胺侧链。盐酸克伦特罗为国家按兴奋剂管制的β2-受体激动剂,目前,β2-受体激动剂已有20多种,我国禁止所有β2-受体激动剂用于养殖业。近年来,非法使用盐酸克伦特罗(非法用于养殖时俗称“瘦肉精”)饲养生猪事件屡禁不绝,严重危害食品安全和人民群众身体健康。一些不法养殖户转向购买人用盐酸克伦特罗或其他β2-受体激动剂直接饲喂生猪。本文在已有的方法基础上改进了仪器方法,
睿科仪器新推出的全自动固相萃取系统,与串联四极杆液质联用系统可以同时测定九种β2-受体激动剂。实验证明该方法快速、简单,灵敏度高,完全达到了国内,欧盟和日本的要求。
试剂
标准品化合物的结构见图1。乙腈购买于Fisher公司,甲酸购买于Merck公司,甲酸铵购买于Acros Organics公司,水为Milli Q。
图1. 被测β2-受体激动剂的结构
试样制备与保存
牛、猪肌肉组织:若为冷冻样品,将其放置室温下化冻。从原始样品中取出部分有代表性样品约100g,经组织搅拌机将样品均匀搅碎,用四分法缩分出适量试样,均分成两份,装入无菌采样袋中,加封后作出标记,一份作为试样,一份作为留样(-18℃保存),试样再利用匀质机10000r/min转速下将样品制备均匀。
样品前处理
样品制备
提取
1)称取制备好的样品2.00(±0.02)g,置于50mL离心管中,加入8mL乙酸钠缓冲液,再加入50μLβ-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶,匀质机匀质30s(10000 r/min),37℃水浴酶解12h。
2)取出后放置室温,加入100μL β-激动剂内标工作溶液(8.7),100μL β-激动剂加标溶液,加盖后涡旋振荡, 离心10min(5000 r/min),取4mL上清液加入0.1mol/L高氯酸溶液5mL,混合均匀,用高氯酸调节pH值至1±0.3。离心10min(5000 r/min),将全部上清液转移至另一50mL离心管中,用10mol/L氢氧化钠调节pH值至11。
3)加入10mL氯化钠饱和溶液和10mL异丙醇-乙酸乙酯(6+4)混合溶液,加盖至于水平振动器振荡10min。在5000 r/min下离心10min。 转移全部的有机相,在40℃水浴下氮气将其吹干。
4)加入5mL pH=5.2的乙酸钠缓冲溶液,涡旋振荡10s后,进行SPE净化
净化
1)将固相萃取小柱置于固相萃取装置Fotector上,次用5mL 甲醇、3mL水活化小柱;
2)将上述待净化的溶液加入萃取小柱,弃取流出液,然后依次用3mL去离子水,3mL 2%甲酸水溶液(v/v),3mL甲醇淋洗小柱,弃取流出液,并采用负压抽干小柱;
3)10mL 5%氨水氨化的甲醇溶液洗脱目标物,此时收集洗脱液; 系统自动浓缩定容;
4)往管中加入1mL含0.1%甲酸的5%甲醇溶液复溶样品,涡旋震荡后,滤液待测。
分析条件
样品采用串联四极杆液质联用仪进行分析。
液相条件
采用液相色谱仪,配置有脱气机,二元泵,自动进样器。色谱柱: SB-C18, 2.1×100, 1.8μm。流动相组成:A为10mM Ammonium Formate +0.1% Formic Acid水溶液(用乙酸调节pH值4.5),B为乙腈溶剂。流速0.3mL/min,柱温40℃。梯度洗脱。
质谱条件
串联四极杆质谱仪。在(+)ESI模式下,采集数据,设定质谱参数如下:Capillary 4000V,Drying Gas 11L/min,Neb Press 35 psi,Gas Temp 350℃,碰撞气为高纯氮气,Q1和Q3的分辨率均为单位质量分辨。MRM模式下的参数如下:
保留时间 |
化合物 |
母离子 |
子离子 |
驻留时间
(ms) |
碰撞电压
(V) |
碰撞能量
Energy (V) |
4.95 |
特布它林 |
226 |
152 |
10 |
100 |
15 |
170 |
10 |
100 |
30 |
4.98 |
齐帕特罗 |
262 |
244 |
10 |
100 |
10 |
185 |
10 |
100 |
25 |
4.98 |
沙丁胺醇 |
240 |
222 |
10 |
100 |
5 |
148 |
10 |
100 |
15 |
5.04 |
塞曼特罗 |
220 |
202 |
10 |
80 |
5 |
160 |
10 |
80 |
15 |
5.80 |
莱克多巴胺 |
302 |
284 |
10 |
100 |
10 |
164 |
10 |
100 |
15 |
6.15 |
妥布特罗 |
228 |
119 |
10 |
100 |
30 |
172 |
10 |
100 |
10 |
6.18 |
克伦特罗
(瘦肉精) |
277 |
203 |
10 |
100 |
10 |
259 |
10 |
100 |
5 |
6.37 |
溴布特罗 |
367 |
349 |
10 |
100 |
10 |
293 |
10 |
100 |
15 |
6.49 |
克仑潘特 |
291 |
203 |
10 |
100 |
15 |
273 |
10 |
100 |
5 |
6.52 |
马布特罗 |
311 |
237 |
10 |
100 |
15 |
293 |
10 |
100 |
10 |
6.83 |
马喷特罗 |
325 |
237 |
10 |
100 |
15 |
217 |
10 |
100 |
25 |
表2. MRM模式下的质谱参数
结果与讨论
实际样品添加了2ppb的激动剂,经萃取、净化等步骤,其回收率在80-100%之间。其检测灵敏度, 如瘦肉的灵敏度可达10ppt。
图2. 0.5ppb的β2-受体激动剂测得的谱图
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