高效&快速——色谱技术永恒不变的主题

　　仪器信息网讯 2010年全国生物医药色谱学术交流会于2010年5月9日在江西景德镇落下帷幕，色谱领域内的知名专家学者共聚一堂，探讨色谱技术及应用的新进展，分享各自最新的研究成果。本网编辑有幸参与此次盛会，受益匪浅，此篇选择“高效&快速”为主题，为网友们呈现会议上与此主题相关的“亮点”。

　　一、在实现“高效&快速”方面，液相色谱填料功不可没

　　(此部分内容主要来自于中国科学院化学研究所刘国诠研究员在大会上所做的综述报告“液相色谱柱进展与展望之填料三议”)

中国科学院化学研究所刘国诠研究员

　　1、更小粒径的填料催生了超高效液相色谱的诞生

　　根据色谱速率理论，粒径越小，柱效越高，而且当粒径小到亚2微米左右时，线速度的提高，其分离度就不再降低，从而改变了许久以来人们不得不在“速度和分离度之间取舍”的局面。但问题是，粒径减小带来了柱压的急剧升高，因此对系统的耐压性能要求很高。从2004年至今，前后已有沃特世、安捷伦、赛默飞世尔、Jasco、岛津、日立、Scientific Systems、戴安、Kuauer、珀金埃尔默等10家公司推出了基于亚2微米填料的超高效液相色谱，这已然成为液相色谱发展的主要方向之一。

岛津公司技术与应用报告会现场

岛津公司Nexera UHPLC LC 30A

    此次会议上，岛津公司推介了其最新一代超高效液相色谱系统Nexera UHPLC LC 30A，该系统将系统的最高耐压性再次提高，最高可达到130MPa。（本网曾参加该款产品的发布会，并撰写相关报道：岛津推出新型“超高效液相色谱仪”）

　　那么，填料的粒径会一直小下去吗?鉴于亚2微米填料所带来的对系统要求更高、更严的状况，使得用户与厂商去寻求粒径与压力的平衡点。实践中，人们发现使用粒径2-3微米的填料，可获得比常用3-5微米填料更高的柱效，但却能以60MPa的压力甚至常规液相使用压力即可驱动，由此使得2-3微米填料正在成为业界的新宠。应该说，减小粒径是提高分离效率和分离速度的一种有效手段，但不是唯一手段。

　　2、另一种提高柱效的思路——核壳型填料

　　核壳型填料就是从改善传质过程的角度来提高分离效率和分离速度。早在1964年，就有文献报道此种填料的制备方法，核壳型填料就是在坚实的硅胶核心上生成一个既坚稳又均匀的多孔外壳。核壳型填料颗粒并不完全多孔，这样分析物穿过色谱柱时只需要花费少量的时间便能扩散出颗粒孔中，较短的扩散路径导致更快传质的进行，并且有优异的柱效。研究表明，同样尺寸的核壳填料，柱效为亚2微米柱效的80%，压力却只亚2微米的45%。目前，生产和供应核壳型填料的厂家有安捷伦、Supleco、菲罗门、Chrome Matrix、Sigma-Aldriich。

　　3、实现快速分离的关键——以对流传质取代扩散传质之贯流色谱

　　在贯流色谱填料上，既有30-150nm的中孔，又有贯穿整个颗粒的，孔径约600-800nm的超大孔存在，这个贯通的超大孔可以允许流动相直接进入填料颗粒的内部并贯穿而过。贯穿孔将填料分割成很多更小的颗粒，相当于减小了填料的粒径，提高了色谱柱的柱效，并且其可以允许使用更高的流速，实现快速分离。此外，基于这个理论，一些新型的色谱填料和柱型相继开发成功：膜色谱柱、整体柱、无孔柱填料。

　　4、耐高温的填料颗粒

　　实现快速分离的又一途径即优化分离温度，特别是对生物大分子尤为如此。温度升高，流动相粘度降低，操作压力下降，同时还有利于快速分离。但是要求填料耐高温性能好，样品的热稳定性好。在基于亚2微米的超高效液相色谱系统中，其实对这点因素也有考虑，柱温箱的最高温度都有所提高，岛津最新推出的超高效液相色谱其柱温箱的最高温度可高达150℃。

　　5、分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)

　　分子印迹聚合物是采用模板聚合法制备对模板分子具有选择性记忆、识别能力的高分子聚合物。通常，利用自组装在模板分子周围的烯类单体分子，经聚合、交联后，将模板分子从高聚物中洗脱取出，便可在高聚物中留下与模板分子几何形状相匹配的空穴。这些空穴对模板分子的选择性记忆能力使分子印迹聚合物与模板分子之间构成类似生物界抗体与抗原间专一的“锁”与“钥匙”的关系。

目前，该方法在蛋白分子分析中应用正方兴未艾，有着诱人的前景。但是其也面临以下几个难点：(1)蛋白分子对环境条件敏感;(2)适合于水相中反应的单体、交联剂、引发剂种类较少;(3)生物大分子表面存在众多类型的结合位点;(4)体积大，传质洗脱困难。

不过刘国诠研究员认为，(1)目前制约蛋白质分子印迹的缺点终将克服，MIP可以在特殊场合发挥不可替代的作用;(2)使用小分子配基的亲和色谱填料将与MIP在许多应用中争锋;(3)合成低峰展宽的分子印迹材料是一个诱人的课题。

　　二、抛开填料颗粒，另辟蹊径实现“高效&快速”

戴安技术与应用报告会现场　

双三元梯度液相色谱-DGLC
　

　　1、双色谱柱模式

　　色谱分析中，除了样品的分离时间外，色谱柱还需有一个平衡时间。戴安公司在其技术与应用报告会上介绍了其双三元梯度液相色谱系统，该系统配备了两个三元低压梯度泵和两个色谱柱，用户可以用一根柱子分析样品，另一个柱子平衡，通过在两者间的来回切换实现了分析的“快速”。同时其可以连接在线固相萃取装置，将样品前处理时间也大大缩短，再次实现了分析的“快速”。

西北大学现代分离科学研究所、现代分离科学陕西省重点实验室的耿信笃教授

　　2、色谱饼(Chromatographic cake)

　　色谱饼是一种特殊的液相色谱柱, 其柱直径远远大于柱长，呈饼形。来自西北大学现代分离科学研究所、现代分离科学陕西省重点实验室的耿信笃教授正是用这种特殊的“色谱柱”实现整体蛋白的快速分离。通常的快速分离仅指样品从进样到样品中的组分流出色谱柱的时间，而一个连续的分析样品过程中应该包括柱平衡时间、进样和洗脱时间、柱再生时间等，此方法所实现的“快速”属于后者。

　　众所周知，蛋白分离的效果基本上与柱长无关，这就提供了一个用短柱分离整体蛋白，在高速条件下快速分离的可能性，当然，前提是分离度不能有显著的损失。耿教授课题组将3微米的多孔RPLC填料装在直径1厘米，厚度1毫米的色谱饼中，以10mL/min流动相流速，1分钟内分离了7种整体蛋白，实现了高速度(1分钟)、高分离度(反相分离7种蛋白)、高样品量(1mg)、高重现性。这种蛋白分离方法可以应用于临床的快速分析。

　　3、固定相优化色谱(Phase Optinized Liquid Chromatography POPLC)

　　在色谱分析方法研究中，通常情况下都是通过优化流动相来改善色谱分离效果，但是来自中科院上海药物研究所的陈冬英研究员却使用了完全不同的方法——“优化固定相”来改善色谱的分离。方法中使用的是德国BISCHOFF公司新近开发的POPLC系统，该系统由迷你柱管、填装了不同填料的可替换短柱芯和分析软件三部分组成。在实验中，先选择几根装有不同填料的短柱芯作为一个实验组，通过单根柱子先做基础实验，然后用配套软件计算可能的柱连接，即将装有不同填料的短柱芯进行串联，例如: 常规C18、增强过极性的C18、苯基、C30或氰基等，再预测分离效果，最后做验证实验。陈老师将此种方法用于某些药物的分析，发现POPLC可有效缩短分离时间，相应提高检测灵敏度。

　　三、可能的未来

　　1、绿色液相色谱

　　当今，“低碳环保”已经渗透到我们生活的方方面面，那么液相色谱如何“绿色”呢?岛津公司在其技术与应用报告会上介绍了新近推出的Nexera系统只用水作为流动相分离样品。该系统配备了高温柱温箱CTO-30A，最高温度可达到150℃ ，在如此高的温度和压力下，流动相纯水处于亚临界状态，其对物质的溶解性有很大提高。目前，虽然用纯水做流动相还只能用于分析简单的样品，应用也很有限，不过，随着技术的进步，绿色液相色谱可能会有更广泛的应用前景。

　　2、CAD取代ELSD

　　“电雾式检测器(CAD)将取代蒸发光散射检测器(ELSD)检测器!”在戴安公司技术与应用报告会上，其应用研究中心梁丽娜博士提出这一说法并给出了理由：因为CAD在灵敏度、响应一致性、动态范围、重现性等方面均优于ELSD。梁丽娜博士还谈到：CAD所兼容的流速范围比较广，因而它不仅可用于高效液相色谱，还可用于超高效液相色谱，并且，CAD与质谱检测器有着应用交叉之处，即当流动相不易挥发且检测化合物没有紫外吸收时，二者都能适用，但CAD或许是更好的选择，因为它更易学易用。