新进展——晚期结直肠癌中NKG2D-CAR基因修饰的NK细胞过继输注的研究

华粤行

2020/04/22 17:09

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结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率和死亡率分别位居第二位和第三位。结直肠癌发病隐匿，早期症状不明显，约20%的结直肠癌患者在诊断时就已发生远处转移。对于转移病灶不可切患者的治疗主要以姑息性化疗和靶向治疗为主，其治疗效果差强人意。

2018 年诺贝尔医学及生理学奖获奖者美国德克萨斯大学的免疫学家詹姆斯·艾利森（James Allison）和日本日本京都大学的免疫学家本庶佑，他们的研究提供了一种通过刺激免疫系统来对抗肿瘤细胞的癌症治疗方法，并且基于这些研究也开发出了相应的药物，人类在治疗肿瘤上已经取得了非常重要的突破。然而，由于肿瘤致病机理复杂、患者个体的差异性也很大，再加上环境因素的影响，最终的治疗效果仍然达不到人们的满意。广州医科大学附属第三医院徐学虎教授团队设想通过探索过继免疫细胞输注治疗的方向，以期能改善目前对晚期结直肠癌的治疗现状。

过继免疫细胞输注治疗是一种不同于免疫检查点抑制剂的新型的抗肿瘤免疫治疗模式。其中嵌合抗原受体T细胞免疫治疗（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T）被认为是当前具前景的抗肿瘤治疗方式之一。而嵌合抗原受体NK细胞免疫治疗（CAR-NK）异曲同工之妙，将修饰的免疫细胞由T细胞变为NK细胞，而且有越来越多的临床前研究表明CAR-NK细胞同样具有显著的抗瘤能力。

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　　徐学虎教授团队近日在医学1区杂志《Molecular Therapy》（IF：7.008）上报道了“NKG2D-CAR基因修饰的NK治疗结直肠癌患者的临床研究”的试验结果。这是一项单臂、开放，剂量递增的单中心的初期临床研究，共入组了3例经标准治疗失败的转移性结直肠癌患者。

　　在临床前研究阶段，鉴于包括结直肠癌在内的多种肿瘤细胞均高表达NKG2D配体的特征，而在正常组织中其表达含量很低或无，所以团队成员选择肿瘤相关抗原--NKG2D配体作为治疗靶点，并通过电穿孔的手段将NKG2D-mRNA转导NK细胞，成功构建了靶向NKG2D配体的CAR-NK细胞。

首先，徐学虎教授团队利用了NEPA21（电转染仪） mRNA电穿孔方法（来自 NEPAGENE公司的 NEPA21 高效基因电转染系统），从体内外实验中均展示了NKG2D CAR-NK细胞对高表达NKG2D配体的肿瘤细胞显著的特异性杀伤能力。为了比较NKG2Dz和NKG2Dp mRNA-CARs电穿孔NK细胞诱导的细胞毒性免疫反应，在相同的供体和相同的对照条件下，用相同量的mRNA-CARs电穿孔NK细胞，利用EGFP mRNA在NK细胞中优化RNA电穿孔，其转染效率接近99%（图S2）。实验结果表明，NKG2Dp-CAR修饰的NK细胞更有效地杀伤癌细胞。基于这些结果，NKG2Dp-CAR修饰的NK细胞作为动物和临床试验的研究目标。

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mRNA电穿孔后24小时进行流式细胞术分析

　　为了验证NKG2D RNACAR修饰的NK细胞在体内的抑瘤作用，建立异种植入人结直肠癌细胞株的NSG小鼠模型，利用活体生物成像技术(BLI)比较分别给予phosphate-buffered saline (PBS), NK细胞和NKG2DCAR-NK细胞处理的小鼠体内肿瘤负荷光信号，结果显示PBS组小鼠平均生存时间为36天，低于NK细胞组小鼠平均45天的水平，说明NK细胞对延缓肿瘤生长提高小鼠生存时间具有一定疗效，而NKG2D CAR-NK细胞组全部5只小鼠的肿瘤生长被抑制，并且平均生存时间提高到69天，由此可见，CAR-NK细胞能够有效的杀伤小鼠体内肿瘤。

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随后，对3例化疗难治性转移性结直肠癌患者进行了一项初步临床试验研究，以评价NKG2Dp-CAR基因表达修饰的NK细胞过继细胞治疗的安全性和可行性。先为三例病人制备CAR-NK细胞，并展示了用于患者治疗的CAR-NK细胞的产生和特性，包括CAR-NK细胞释放标准和电穿孔后CAR-NK细胞的活性（图S4）。

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对生成的CAR-NK细胞进行质量控制，以确保患者输液符合标准

NKG2D-CAR mRNA电穿孔后，NKG2DMFI大于原水平的1.2倍

随后，在临床试验中验证NKG2D-CAR基因修饰的NK细胞过继治疗的安全性和可行性。研究一共入组了3例经标准治疗失败的转移性结直肠癌患者，前两例为有腹腔转移伴恶性腹水患者，以剂量递增的形式通过腹腔输注的方式分别给予2次（2×107-1×108个CAR-NK细胞）和4次（1×108-7×108个CAR-NK细胞）细胞输注，每周一次。治疗过程中和结束后，可观察到24小时腹水生成量以及腹水中肿瘤细胞数的显著减少；同时，第二位患者CT平扫亦显示治疗后腹腔内腹水含量较基线减少；腹水性状从浑浊状变为淡黄色澄清状。

第三例为腹腔转移伴不可切除的肝转移性结直肠癌患者，一共给予6次（5×108-2×109个CAR-NK细胞）细胞输注，每周两次。从第二次输注开始，一半细胞通过超声引导下局部输注至PET-CT显示为高代谢活性的肝右后叶下段（S6），剩余细胞则通过腹腔内输注。治疗结束后，通过治疗前后PET-CT对比，可观察到局部输注肿瘤灶（S6）的代谢恢复至背景值，且通过组织切片染色证明局部输注肿瘤组织的大量坏死。