人胆固醇-25-羟化酶(CH25H)elisa试剂盒
实验目的:
本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人胆固醇-25-羟化酶(CH25H)的含量
实验原理:
本试剂盒应用双抗体夹心法测定大鼠标本中人胆固醇-25-羟化酶(CH25H)水平。用纯化的人胆固醇-25-羟化酶(CH25H)捕获抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被的微孔中依次加入人胆固醇-25-羟化酶(CH25H),再与HRP标记的检测抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胆固醇-25-羟化酶(CH25H)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人胆固醇-25-羟化酶(CH25H)含量。
英文名称 | Human Cholesterol-25-Hydroxylase(CH25H)elisa Kit |
规格 | 48T/96T |
货号 | PH102439 |
产品类别 | Human/人elisa试剂盒 |
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试验所需自备物品:
1. 酶标仪(450nm波长滤光片)
2. 37℃恒温箱,双蒸水或去离子水
3. 自动洗板机
4. 高精度移液器, EP管及一次性吸头: 0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
5. 吸水纸
检测程序:
1. 加样:空白孔加入50μl标准品/样品稀释液,其余孔各加入标准品或待测样品50ul,将反应板混匀后置37℃,40分钟。
2. 洗板:用1×洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,每孔加入1×洗液350μl,每次震荡/浸泡1-2分钟,向滤纸上印干。
3. 空白孔加入100ul生物素化抗体稀释液,其余孔各加入1×的生物素化抗体工作液100ul,混匀后置37℃,30分钟。
4. 洗板:同上。
5. 每孔加入SABC复合物工作液100ul,混匀后置37℃,20分钟。
6. 洗板:同上。
7. 每孔加入提前配置好的TMB混合液100ul,混匀后置37 ℃暗处反应10-20分钟(具体显色时间根据显色结果而定)。
8. 每孔加入100ul终止液,混匀,30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
结果判断与计算:
1. 所有OD值建议减除空白值后再行计算,如空白OD低于0.1,也可以直接计算。
2. 以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,手工绘制或用软件绘制标准曲线,根据样品OD值计算出相应含量,再乘上稀释倍数即可。
试剂盒性能:
1、 检测范围:0.625-40ng/mL
2、 特异性:同时可检测重组或天然的某种蛋白或抗体,不与其它细胞因子有交叉反应。
3、 重复性:板内,板间变异系数均小于10%。
操作步骤:
1.加样→2.温育→3.配液→4.洗涤→5.加酶→6.温育→7.洗涤→8.显色→9.加终止→10.测定。
1.使用前,将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产生加样上的误差。
2. 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数,每个标准品和空白孔建议做复孔,每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1:1稀释后加入50ul于反应孔内。
3. 加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体,盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育1小时。
4. 甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次,如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
5. 每孔加入50ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育30分钟。
6. 甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次,如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
7. 每孔加入底物A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37℃温育10分钟。避免光照。
8. 取出酶标板,迅速加入50ul终止液,加入终止液后应立即测定结果。
9. 在450nm波长处测定各孔的OD值。
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