RAPA3G SYBR Green qPCR Mix
商品属性:
货号 | 规格 | 产品名称 |
P-PR1262-1ml | 1ml | RAPA3G SYBR Green qPCR Mix |
P-PR1262-5ml | 5ml | RAPA3G SYBR Green qPCR Mix |
产品介绍:
描述:
本制品是采用 SYBR Green 嵌 合 荧 光 法 进 行Real-Time PCR 的专用试剂,本 SYBR Green qPCR Mix将化学修饰的热启动 RAPA3G DNA 聚合酶、反应 Buffer、dNTP、SYBR Green 染料等试剂预混在一起,是一种 2×浓度的单组分预混试剂。该制品配有单独的 ROX 内参染料,可用于需要 ROX 进行孔间校正的定量 PCR 仪。RAPA3G DNA 聚合酶为第三代 DNA 聚合酶,其具有最高的杂质耐受性(对乙醇、胍盐、肝素具有极高的耐受性),因此对于纯度较差的 DNA 模板,该 Mix 仍然可以获得理想的实验结果。RAPA3G DNA 聚合酶为化学法修饰的 HotStart版本,其在 50℃以下 100%无活性,只有 95℃条件下加热5min 后才能完全恢复酶的活力。因此该系统可以有效抑制非特异性 PCR 扩增,极大的提高了 PCR 扩增特异性。该试剂盒独特的反应缓冲液,可在宽范围中得到良好的扩增结果、检测灵敏度更高、信号更强。
包装
规 格
2×RAPA3G SYBR
Green qPCR Mix
50×ROX Dye
1ml (A2250A) 1 ml 200 μl
5ml (A2250B) 1 ml×5 200 μl
储存:
请避光置于-20℃以下可保存3年。该试剂经 30 次冻融后性能无下降,因此不使用时请置于-20℃避光保存。
操作方法:
1. 根据机型选择步骤 A 或 B
A: 需要添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的 Real-TimePCR 仪,包括:ABI PRISM7900HT, 7300/7500/7500 FastReal-Time PCR (Applied Biosystems);Mx3000P(Stratagene)等。按照如下组分配制 20 μl PCR 反应体系:终浓度
2×RAPA3G SYBR Green qPCR Mix 10 μl 1×
50×ROX Reference Dye 0.4 μl 1×
PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
注意事项:
注意:引物用量有时可提高到 0.8 μl 以提高扩增效率。B:无需添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的 Real-TimePCR 仪,包括:LightCycler (Roche Diagnostics); CFX96Real-Time PCR(Bio-Rad & MJ);Line-Gene等。按照如下组分配制 20 μl PCR 反应体系:终浓度
2×RAPA3G SYBR Green qPCR Mix 10 μl 1×
PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
2. 进行 Real-Time PCR 反应,通常采用两步法,程序如下:
Stage 1: 95℃ 5min*
Stage 2: 95℃ 10s
60℃ 20s 40 cycles
Stage 3: Dissociation analysis
注意:由于该酶为化学修饰的热启动 RAPA3G DNA 聚合酶,必须于 95℃加热 5min 才能恢复酶的活性,该热启动步骤不能缩短时间。
3. 反应结束后确认 Real-Time PCR 的扩增曲线、融解曲线和标准曲线。
pcr相关试剂实验结果分析:
PCR实验结果的分析涉及多个方面,包括实验操作、试剂质量、实验条件等,这些因素都会影响PCR实验的成功率和结果的准确性。以下是对PCR实验结果分析的一些关键点:
循环次数过多:增加模板量减少循环次数,缩短退火时间及延伸时间,或改用两种温度的PCR循环,可以有效避免循环次数过多导致的问题。
退火温度过低:退火温度的适当调整对于PCR反应的成功至关重要,过低的退火温度可能导致非特异性扩增,影响结果的准确性1。
电泳体系问题:包括凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大、凝胶没有凝固好、琼脂糖质量差等问题,这些都会影响DNA片段的分离效果。
试剂盒问题:运输储存不当可能引起试剂盒失效,试剂盒本身质量问题如引物选择、循环参数设置不当也可能导致实验失败1。
降解的陈旧模板:使用降解的陈旧模板进行扩增容易产生涂布,影响结果的解读1。
PCR假阴性结果:可能由引物长度不够、试剂浓度不标准、靶序列突变或缺失、循环参数设置错误、标本中有Taq酶抑制剂、PCR产物检测系统灵敏度不够等因素引起。
为了获得准确的PCR实验结果,需要注意以下几点:
确保PCR反应体系中各种试剂的配比和操作步骤的精准度。
在PCR反应过程中需要对PCR产物进行实时监测,以便及时对反应条件进行调整。
防止样本的污染和交叉感染,以免影响PCR反应的准确性和可靠性。
通过上述分析,可以更好地理解和控制PCR实验中的关键因素,从而提高实验结果的准确性和可靠性。
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