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无需切片的三维大组织成像研究

明准医疗

2024/08/08 16:28

阅读：5

空间组学、空间生物学技术发展日新月异，对生物特征的观测正逐渐从二维推向三维升级。以神经系统为例，其复杂空间结构难以通过二维切片进行完整观测。传统三维信息获取方法依赖串行薄片重建，其技术挑战大，耗时长，容错率低，易导致信息丢失或变形，难以获得理想体积重建效果。

生物大样本三维非切片跨尺寸成像时代

生物标本本质上具有三维特性。因为可见光在生物组织中具有较弱的穿透深度，因此传统生物学需将三维组织进行二维切片，以减少离焦面信息对目标深度的影响。因此基于石蜡切片的二维成像成为了生命科学研究中不可或缺的观测工具。然而，二维切片具有难以避免的局限性（如图1所示）。

图1. 二维切片与三维整体结构的对比图^[1]

场景1：盘绕弯曲形状的三维形态

如：脉管系统、神经元、淋巴管、腺体等。

场景2：复杂细胞分布的评估

如：肿瘤、纤维化、免疫介导的炎症性疾病等复杂结构（微环境）。

场景3：检测稀有或稀疏物体，识别稀有细胞或药物靶标

如：基因标记的稀有细胞、药物在靶点研究中的生物分布、干细胞/祖细胞研究及PDX 模型中的子克隆等。

光片显微镜在三维成像中具有显著优势

图2. 三维非切片成像技术对比^[2]

三维非切片成像技术可多次成像同一组织样本。处理大样本时，焦平面上下区域的失焦信息可能干扰成像质量。1988年，Marvin Minsky研发了共聚焦显微镜，通过小孔过滤非焦面光信号，开启了“光学虚拟切片”技术。随后，激光扫描共聚焦显微镜、激光扫描双光子显微镜和转盘共聚焦显微镜等技术逐步商业化（如图2）。

真正意义上使用光来进行“切片”的技术—光片显微镜（Light Sheet Microscope，图2C），其历史可追溯到1903年。

图3. OPFOS（左）和SPIM（右）技术原理^[3^,4]

1990年代，华盛顿大学Francis实验室研发了正交平面荧光光学切片装置（OPFOS），实现了对整个耳蜗的清晰荧光图像捕捉，为相关研究领域提供了技术支撑（Spelman F. A., J. Microsc. 1993）。

2004年，Jan Huisken在《Science》上发表了关于SPIM技术的论文，推动了光片显微镜技术的进步和现代化应用，并凸显了其在胚胎发育研究中的实用性。该论文提供了青鳉神经节细胞搏动和果蝇胚胎发育的荧光图像作为实证。Jan Huisken因此被公认为光片显微成像技术的先驱者之一。

图4. 共聚焦和光片显微镜工作原理对比^[5]

光片显微镜是目前唯一兼具低光损伤、高成像对比度、大视野、深度采样、三维成像速度快的高端显微成像仪器。

2014年，光片成像技术被Nature methods选为Method of the Year 2014。

生物大样本成像挑战

光学切片技术的进步推动了荧光三维成像成为20世纪末显微镜首选，成像深度从几十微米提升至几分之一毫米（Denk等，1990）。基因编码荧光蛋白提供了高特异性标记方法，无需抗体扩散，实现了更深入成像（Chalfie等人，1994）。但组织异质性导致的光散射阻碍了厚组织高分辨率三维成像研究。

图5. 生物组织中影响光传播的因素^[6]

组织透明化技术

2013年，斯坦福大学Deisseroth实验室开发的CLARITY技术实现了小鼠全脑透明，获取了神经网络3D图像，入选Science杂志“十大突破技术”。《Nature》评论称脑组织切片研究时代或终结。

CLARITY技术通过生化试剂去除光散射组分，实现组织光学均质性，保持完整细胞结构和分子组成，改变大脑研究方式。该技术逐渐扩展至多类型方法和器官系统应用。

组织透明化技术已发展出多种方案，总体分三类：

图6. 组织透明化技术分类^[7]

1、有机溶剂方案：如BABB、PEGASOS、iDISCO等（图6 A）；

2、水性溶液方案：如Scale、Ce3D、CUBIC系列等（图6 B、C）；

3、水凝胶方案：如CLARITY、SHIELD、PACT等（图6 D）。

对于动物组织器官来说，无论是哪种透明化方案，最核心的步骤都含有：预处理（脱色、脱钙等）、脱脂、染色和折射率匹配四个步骤。

在选择研究方案时要衡量许多因素，比如样本类型，透明程度、荧光保护、抗体（探针）兼容、样本处理和染色时间等，明准医疗推出定制化的组织透明化方案及高性能光片显微镜成像一站式服务，为您提供基于三维无损结构的生物学跨尺寸成像研究新思路。

新一代光片显微镜

明准INTOTO系统

INTOTO 光片显微镜采用先进的光学设计，实现空间生物学的多尺度成像，轴向分辨率较传统光片系统有明显提升。此外，该技术还具备倒置成像、折射率匹配系统，确保从亚微米到毫米级别的跨尺度成像，该设备以其各向同性分辨率、低光损伤、高成像对比度等特点，为生物学研究提供了一个全新的观察窗口。

研究＆应用方向

1、三维病理学

2、神经生物学

3、脏器、血管、淋巴管及骨骼三维结构

4、胚胎发育（线虫、斑马鱼、小鼠胚胎）

5、 3D细胞培养、类器官

6、植物学

服务试用

公司介绍

深圳明准医疗科技有限公司（Shenzhen Intoto-biotech Technology Co., Ltd.）是一家专注于高端显微成像仪器研发和科研服务的高科技企业。公司依托先进的光片显微镜技术，为生物学研究提供多尺度成像解决方案，助力科研人员深入探索生命科学的奥秘。

参考文献：

1. Liu, J.T.C., Glaser, A.K., Bera, K. et al. Harnessing non-destructive 3D pathology. Nat Biomed Eng 5, 203–218 (2021).

2. Ronzitti E, Emiliani V and Papagiakoumou E (2018) Methods for Three-Dimensional All-Optical Manipulation of Neural Circuits. Front. Cell. Neurosci. 12:469.

3.Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A., Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 1993, 170, 229–236.

4.Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H., Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science 2004, 305, 1007–1009.

5.Jan Huisken, Didier Y. R. Stainier; Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development 15 June 2009; 136 (12): 1963–1975

6.Tian T, Yang Z, Li X, et al. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. J Anat. (2021).

7.Douglas S. Richardson, Jeff W. Lichtman, Clarifying Tissue Clearing. Cell (2015).

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