提高单次数字全息显微镜在两个正交方向上的分辨率

摘要

我们展示了一种单镜头数字全息显微镜技术，通过双通道正交偏振复用方法同时提高两个正交方向上的衍射极限分辨率。采用正交偏振的两个倾斜光束照射样品，在定制设计的马赫-曾德尔配置中，两个相互正交偏振的参考光束与物体光束干涉。该技术有可能有利于在单个记录全息图中同时编码来自两个正交方向的高频样本信息，其中通过选择性光谱拼接合成高频光谱。因此，在这项工作中，单次拍摄全息图的分辨率沿两个方向增强。模拟和实验结果都显示了所提出的技术的分辨率在衍射极限上提高了约2倍。

关键词

正交极化；数字全息显微镜；超分辨率

1.简介

数字全息显微镜（DHM）（Kim，2011，Kim，2010）由于其在无标记样品可视化（Di Caprio et al.，2010，Belashov et al.，2016）、生物组织和细胞的无损分析（Kemper et al.，2010Rodrigo et al.，2017）、细胞的折射率断层扫描（Charrière et al.，2006，Kühn et al.，2009）等方面的潜在应用，已成为一种流行的成像方法。然而，传统DHM的空间分辨率受到衍射的限制（Abbe，1873）；这不足以研究具有详细特征和更精细特征的生物样品。因此，科学家和研究人员创新并开发了各种方案来超越DHM的衍射极限分辨率。更短的波长（深紫外光）已经利用照明（Faridian等人，2010，Anand等人，2011）来可视化具有纳米级结构的样品。这需要在实验设置中使用昂贵的紫外线（UV）光学器件；高能量的UV光子也更倾向于生物样品的光损伤。已经报道了一种基于合成孔径的DHM技术（Micó等人，2008），其中成像系统的通带极限通过各种方式扩展，并最终提供更好的分辨率。有几种基于结构照明（Heintzmann和Huser，2017，Samanta和Joseph，2021）的技术（Samanta等人，2022，Samante等人，2023，Samantta等人，2021）主要用于超分辨率荧光显微镜。然而，这些方法已经在DHM中实现，以实现更好的分辨率全息成像。在DHM中使用光栅（Chowdhury和Izatt，2014）或双棱镜（Sánchez Ortiga et al.，2014b）产生的结构化场几乎是最终重建图像分辨率极限的两倍。存在空间光调制器辅助的DHM技术（Gao等人，2013，Lai等人，2018），与基于光栅或双棱镜的方案相比，该技术提供更快的成像能力。此外，还开发了基于横向剪切干涉的结构化照明DHM（O’Connor et al.，2019）技术来提高分辨率。然而，这些方案需要照明图案的相移；因此在图像重建期间由于不准确的相移而有可能获得伪影。在光栅（Mico et al.，2007）、分束器（赵et al.，2010）和空间光调制器（Lai et al.，2017）辅助方案中，通过每个方向的单次全息图，采用偏振多重斜射光束来提高分辨率；需要多个镜头来提高其他方向的分辨率。此外，在这些方法中捕获多帧以实现高分辨率，需要很高的时间稳定性，并且从光损伤和光毒性的角度来看，多次曝光不适合生物样品。尽管波长复用的DHM方法在没有多次曝光的情况下显著记录多通道，但这些技术（Kühn等人，2007，Turko等人，2018，Polschikova等人，2022）并不能提高系统的分辨率。在DHM中还有一些基于合成孔径的方法可以实现超分辨率。六组离轴配置（Mirsky和Shaked，2019）用于动态成像，其中六个光学压缩全息图中的每一个都编码不同的空间频率信息。另一项研究（Lai et al.，2015）证明了使用光谱归一化来提高分辨率的DHM中合成孔径的光谱重叠。

在这里，我们描述了一种DHM技术，该技术将角度和偏振复用与两个方位角正交的平面波照明相结合，可以通过单帧采集在两个正交方向上提高分辨率。在文献中，通过使用角度和偏振复用，仅在单个帧的一个方向上实现分辨率增强（Yuan et al.，2011）。较高空间频率的对象信息在检测通带内由两个倾斜平面波束下调制，这两个倾斜的平面波束以相互正交的偏振通道在方位角上相互正交。这两个包含不同频率信息的光束在混合马赫-曾德尔干涉仪设置中与两个正交偏振的参考光束干涉，以在单个全息图中同时编码来自2个方向的高频样本信息。通过适当的计算算法对记录的双通道偏振复用全息图进行后处理，其中通过缝合携带高频信息的全息图的不同光谱波瓣来生成合成光谱。选择物体和参考光束之间的偏振选择性干涉只是为了避免傅立叶空间中的任何光谱重叠，并使后处理方案更容易。通过仿真和实验验证了该方法的分辨率提高。

2.理论与仿真

在斜向照明场景的基础上，提出了双通道偏振复用数字全息显微镜的理论模型。在亮场显微镜中，样品用正入射光照明，样品的观察信息含量受到显微镜通带的限制，如图1（a）所示。另一方面，图1（b，c）所示的左右倾斜照明方案在通带内移动高频信息。在传统的DHM中，样品由垂直入射到样品上的轴上平面波照射，并与平面参考波干涉。在这种情况下，记录的全息图受到显微镜通带的限制，如图1（d）中的傅立叶光谱所示。如图1（e）所示，通过使用倾斜光束进行照明，记录的全息图包含高的空间频率，从而通过每个方向的单次拍摄全息图来提高分辨率；而在我们的情况下，样品由倾斜入射到样品的具有正交偏振的两个平面光束照射。在矢量形式的全息图的记录平面中由水平和垂直偏振光束携带的复杂物场分布是，

是复杂的对象函数；是成像系统的点扩展函数；是角波数；是沿着偏振方向的单位场矢量；下标h和v代表水平和垂直分量，因此。方向余弦的波矢量由的是球面极坐标中的倾斜角和方位角。通过选择不同的值，可以收集不同方向的空间频率分量和。在我们的项目下，和个已被考虑；即，从两个正交方向照射样品，同时收集相应方向上的水平和垂直高频分量，它们之间没有任何重叠。在双通道偏振编码全息图的参考臂中，具有相互正交偏振的两个平面参考光束的电场分布表示为，

记录的双通道偏振复用全息图是由两个物体光束和两个参考光束的干涉产生的同时干涉图。具有特定偏振状态的物体光束选择性地与相同偏振状态的参考光束干涉。全息图的强度分布由，

方程中全息图强度表达式中的等式(3)对应于中心分量，而交叉项携带样品的高频信息。如图1（f）所示的全息图的频谱由傅立叶变换表示，

是成像系统的相干传递函数（CTF），并且表示全息图的中心分量的傅立叶变换。从等式(4)中可以观察到，五个不同频率波瓣的位置取决于参考波矢量和目标波矢量。中心波瓣对应于低频对象信息，而旁瓣包含高频信息。每个方向中的对象空间频率分量以便于选择性频谱拼接的方式在空间上分离。在全息图的后处理过程中，从全息图光谱中选择性地选择两个旁瓣，全息图光谱包含物体在两个正交方向上的高频信息。然后，借助于系统通带大小的计算振幅掩模来裁剪选择性波瓣。裁剪的光谱被移动到它们的适当位置，以在两个正交方向上合成扩展通带。然后，借助于系统通带大小的计算振幅掩模来裁剪选择性波瓣。裁剪的光谱被移动到它们的适当位置，以在两个正交方向上合成扩展通带。缝合的频谱由表示，包含两个正交方向上的高频信息。由于我们的传感器保持在图像平面上，因此可以通过对最终缝合的光谱进行傅立叶逆变换来恢复具有高分辨率的完整对象信息。

以自定义设计的分辨率目标为测试对象，进行了基于仿真的研究。图2（a）表示模拟的双通道偏振复用全息图的强度分布（插图显示了所选部分的放大视图）。用于模拟的参数为：照明波长=532 nm，物镜=10X/0.25；物体光束的倾斜角度。全息图光谱中总共有五个项，由等式（4）表示图中的五个不同波瓣表示。第2（b）在全息图光谱中存在两种不同频率分量的混合；它们中的每一个对应于一个正交偏振分量。对光谱波瓣之间的分离进行了优化，使得任何两个波瓣之间几乎没有任何重叠（Sánchez Ortiga等人，2014a）。水平和垂直偏振的参考光束被选择为，和（）以避免频谱重叠。频谱中的四个外波瓣中的每一个的峰值幅度由于离轴物体光束而偏移，并且它包含物体的高频信息。从图中可以看出，如图2（b）所示，全息图光谱中的每个波瓣在每个方向上都包含物体光谱的一半。利用傅立叶变换的共轭对称性，傅立叶谱的一半就足以表示完整的目标信息。因此，通过选择性地裁剪全息图光谱并适当地缝合它们来生成合成光谱。最终，与传统全息图的衍射限制光谱相比，合成光谱包含高频样本信息。从单次全息图来看，通带在倾斜物波的方向上延伸，并在该特定方向上提高分辨率。图图3表示模拟结果，其中图3（a，b）分别是来自常规全息图的正常和倾斜照明的重建图像，图3（c）是来自正交偏振复用全息图的重建图像。为了对分辨率增益进行定量研究，通过线扫描对所选区域进行放大和分析。图3（A–C）表示图3(a–c)所选区域的重建图像的放大视图。重建图像的频谱分别由图3（a–c）和3(d–f) 所示。

图1（a）正常照明，（b，c）左右倾斜照明显微镜的概念；（d）传统全息图、（e）具有倾斜照明的全息图和（f）双通道偏振复用全息图的示意性空间频谱。

图2.模拟结果（a）双通道偏振编码全息图，插图显示放大视图；（b） 全息图的空间频谱（对数尺度）。

图3.利用（a）正常照明，（b）倾斜照明，（c）双通道偏振复用全息图的二维分辨率提高，从传统全息图重建图像；（d–f）分别为（a–c）的空间频谱；（A–C）分别表示重建图像（A–C）的放大视图；（g，h）分别为（A–C）的选定区域的水平和垂直线轮廓。

沿着特定线的水平和垂直线轮廓如图所示。3（g，h）表示传统全息图在正常照明下提供衍射受限图像，而在倾斜照明下提供一维分辨率增益，在正交偏振复用全息图的情况下，在单次拍摄中提供一维分辨率提高。因此，在多路复用全息图重建中出现了一些在传统全息图重构中未解决的精细特征。在所选区域上进行线扫描以量化在我们提出的方法中实现的分辨率增益，该方法显示与1064nm的衍射极限相比，低至640nm的特征被分辨。增益因子是通过所获得的分辨率和衍射限制分辨率之间的比率来计算的。因此，在这种情况下的模拟结果对应于衍射受限图像的大约1.7倍的分辨率提高。到目前为止所描述的模拟结果仅涉及无噪声的情况。然而，这是相当理想的情况，噪声在真实场景中是不可避免的。因此，有必要在模拟研究中加入噪声条件，以模拟实际的实验情况。在模拟研究中，分析了不同光子水平下散粒噪声对最终超分辨图像的影响，以研究我们的技术在各种噪声条件下的性能。在模拟中，通过将不同的信噪比（SNR）水平与每个像素100,101,102和103个光子的平均光水平相结合来生成有噪声的全息图。通过前面描述的相同的光谱拼接方法从不同的合成全息图获得重建图像。从噪声水平为100,101,102和103的不同偏振复用全息图重建的超分辨图像分别为图4（a–d）所示。

图4.（a） –（d）考虑平均光水平的正交偏振复用全息图的重建图像

每个像素的光子数。

表1 我们提出的方法相比较的各种DHM技术的总结

3.实验结果

双通道偏振复用DHM的光学配置示意图如图5（a）所示。它是一个混合马赫-曾德尔干涉仪；参考臂配备了亚马赫-曾德尔干涉仪，而物体臂（图5（b））由衍射光学元件（DOE）和定制的多镜支架（MMM）组成。空间滤波和准直的垂直偏振激光束(Cobolt Samba,S/N: 5823;入=532nm)在被分束器（BS1）分割后，进入混合马赫-曾德尔设置。在干涉仪的物臂中，从反射镜（M1）反射后的光束从DOE（Pluto，Holoeye）上显示的方形光栅衍射成多个阶（Samanta et al.，2019，Tiwari et al.，2020）。只允许两个订单通过一个孔（A）；垂直阶通过半波片（HWP，WPH10M-532，Thorlabs）将偏振态翻转为水平，而水平阶保持垂直偏振。这两个相互正交偏振的平面光束在从定制设计的多镜支架（MMM）反射后照射样品（S）。光束到样品上的入射角可以通过反射镜角度进行调整；由于两个物体光束是正交偏振的，所以物体光束之间不发生相互干扰。在干涉仪的参考臂上，有另一个亚马赫-曾德尔装置，由分束器（BS2）、反射镜M2、M3、HWP和偏振分束器组成（PBS251，Thorlabs）。参考臂包含PBS之后的水平透射和垂直反射的偏振参考光束。使用两个相同的显微镜物镜MO1、MO2（20X/0.4）和两个相同透镜L1、L2（焦距=20cm）来同时收集物体和参考波信息。在分束器（BS3）的帮助下，两个物体光束与两个参考光束相干叠加在一起。在数码相机（Infinity 1–5，Lumenera，CMOS传感器，2592×1944，像素大小2.2μm）的记录平面中捕获双通道偏振编码全息图的强度分布。该帧以30毫秒的曝光时间记录，相机增益为1。在录制帧之前，对设置进行光学校准。由于样品照明不涉及物镜，因此在照明区域上有均匀的亮度。选择低NA物镜（20X/0.4）和管透镜（L1，L2）组合进行采集，并设计设置，使相机视场没有像差和渐晕效应。

通过选择Siemens star（2017 Pair，Ready Optics）作为振幅对象来验证所提出的技术，证明了双通道偏振复用全息显微镜的分辨率增强。选择性地选择来自记录的全息图光谱的两个旁瓣，这两个旁瓣包含在两个正交方向上的物体的高频信息。然后，在系统通带大小的计算振幅掩模的帮助下裁剪选择性频谱瓣，并将其移动到它们的适当位置，以合成两个正交方向上的扩展通带。从而生成合成光谱。然后通过最终合成光谱的傅立叶逆变换获得高分辨率物体信息。结果如图6所示，其中6（a）是实验记录的全息图（插图：偏振复用全息图条纹），6（b）是衍射有限分辨率的传统全息图的重建图像，6（c）是双通道偏振复用全息的二维分辨率改进。图6（A–C）对应于图6的频谱。6（A–C）分别和6（d–e）分别表示重建图像6（b–c）的选定区域的放大视图。沿圆弧的强度扫描轮廓如图6（f）所示。该线轮廓表明，Siemens star的连续尖峰之间的360nm的间隔在超分辨图像中被很好地分辨，而这在衍射极限为665nm的传统图像中是不可分辨的。这种情况下的分辨率增益因子是以与模拟情况相同的方式计算的。实验证明，所提出的方法能够为来自单次正交偏振复用全息图的振幅对象提供沿两个正交方向的1.8倍的分辨率增强。此外，表1中显示了一项比较文献调查，该调查描述了各种现有技术的方法和分辨率增益能力，以及我们提出的关于每个方向的帧数的方法。

图5.（a）实验装置示意图；SF，空间滤波器；CL，准直透镜；BS，分束器；A、孔径；HWP，半波片；DOE，衍射光学元件；PBS，偏振分束器；MO，显微镜物镜；L，透镜；插图显示了定制设计的多镜支架（MMM）的背面视图和（b）样品照明的放大透视图。

图6.Siemens star目标实验结果：（a）记录的全息图（插图：多重全息条纹）；（b） 从衍射有限分辨率的传统全息图重建图像；（c） 双通道偏振编码全息图二维分辨率的提高；（A–C）分别为（A–C）的频谱的频谱；（d–e）分别为重建图像的放大视图（b–c）；（f） 沿着圆弧的强度扫描轮廓。

4.结论

总之，我们已经证明了一种通过交叉偏振复用来提高数字全息显微镜分辨率的技术。由于干涉光束的正交偏振态，同时记录的两个不同全息图之间不存在串扰。通过选择性地选择和拼接全息图的傅立叶光谱的不同波瓣，生成了合成光谱。所提出的实验装置的参考臂的亚马赫-曾德部分可以通过使用45°偏振的单个参考光束的替代方式进行设计，这将降低实验的复杂性。理论研究和仿真结果表明，单次全息图的二维分辨率有所提高。此外，通过实验结果验证了该技术的分辨率增强能力。在所提出的技术中，与传统方法相比，我们已经实现了大约2倍的分辨率增强。然而，通过使用多模态干扰模式（Samanta et al.，2020，Samanta和Joseph，2019）和合适的重建算法，仍有一定的空间进一步提高分辨率。本研究仅限于傅立叶谱对称的物体，因此该技术适用于振幅型物体。正交偏振信道编码不同的样本信息，这超出了本研究的范围，可能是未来的探索。