多重PCR建库技术在植物研究中的应用

PCR（Multiplex PCR）

多重PCR（Multiplex PCR）可在一个反应内加入两对及两对以上的引物，同时扩增两个及两个以上的目标核酸片段。而多重PCR建库技术是一种整合多重PCR及二代测序的靶向测序技术。该方法具有成本低、检测效率高、应用灵活、适应性广等特点。

应用方向

多重PCR建库技术在植物研究中都有广泛的应用。

品种鉴定：国标GB/T38551-2020^[1]已经明确水稻、玉米、大豆、棉花等16个物种可通过MNP方式进行原始品种鉴定、实质性派生品种鉴定和品种真实性鉴定。判断依据则是根据测序后得到的标记位点数进行遗传相似度的计算，最后对比待测品种与对照品种的遗传相似度来定论。万人静等^[2] 研究了MNP在第六大粮食作物木薯品种鉴定的应用，利用241份木薯的全基因组信息筛选到623个MNP标记位点。基于此，在28个木薯品种中两两比较时，99.47%（376/378）的品种对间的差异大于 46%，比例在 0.3%~81.0%之间，均值为 71.78%，MNP具很更高的品种区分能力。

遗传多样性分析：多重 PCR 靶向捕获测序可用于对植物种群中的遗传多样性进行分析。通过选择性引物捕获特定基因组区域, 并对多个样本进行测序比较, 可以研究不同品种或种群中的遗传差异和多态性, 为植物种质资源的保护和利用提供重要的分子标记信息。比如, Zhang 等^[3]利用多重 PCR 靶向捕获测序技术对来自中国海南省和广东省的 998份野生稻种质资源进行了基因分型和遗传多样性评估, 最终构建了 299 份野生稻核心种质资源, 为野生稻的分类、保护和创新提供科学依据。

多重PCR建库技术原理

多重建库技术工作原理^[4]是依靠 PCR 对于靶向位点的定点扩增。对多个待测 SNP 位点设计特异扩增引物，在第一轮 PCR 中抑制引物干扰和非特异扩增，使数以千计的靶向引物能够在一管 PCR 反应中实现高度均一化的扩增，从而大量富集目标片段。随后，在 第二轮 PCR 中，加上测序接头和文库条形码，最终获得测序所需的文库。最后通过大规模并行测序 （massively parallel sequencing，MPS）揭示目标位点的标记基因型。

多重建库流程步骤

多重PCR建库技术的优势

1. 高效性：多重PCR建库技术可以同时扩增多个目标序列，从而提高样品处理的效率。相比于逐个扩增目标序列的方法，多重PCR可以大大减少实验的时间和工作量。

2. 经济性：由于一次扩增可以处理多个目标序列，多重PCR建库技术可以节省试剂的使用量和实验成本。这对于大规模研究和高通量测序项目尤为重要。

3. 信息丰富性：多重PCR建库技术可以同时扩增多个目标序列，从而获取更多的信息。这对于研究复杂疾病、多个基因的相互作用或群体遗传学研究具有重要意义。

4. 准确性和一致性：多重PCR建库技术可以在同一反应体系中同时进行扩增，从而保证了不同目标序列在扩增效率和条件方面的一致性。这可以减少实验中的变异性，并提高测序结果的一致性和可靠性。

5. 灵活性：多重PCR建库技术可以根据研究需要灵活设计引物组合，从而适应不同的实验设计和研究方向。这使得多重PCR建库技术在个性化分析和定制实验中具有很高的灵活性。

多重建库流程

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参考文献

【1】GB/T 38551-2020, 植物品种鉴定 MNP 标记法[S]

【2】万人静，李琼，周新成，李论，李甜甜，周俊飞，彭海，章伟雄，方治伟．木

薯 MNP 标记在品种鉴定中的应用[J/OL]．热带作物学报.

https://kns.cnki.net/kcms/detail//46.1019.S.20230223.1705.004.html

【3】Genetic diversity of wild rice accessions (Oryza rufipogon Griff.) in Guangdong and Hainan Provinces, China, and construction of a wild rice core collection

【4】徐云碧，杨泉女，郑洪建，许彦芬，桑志勤，郭子锋，彭海，张丛，蓝昊发，王蕴波，吴坤生，陶家军，张嘉楠.2020.靶向测序基因型检测(GBTS)技术及其应用.中国农业科学，53(15)：2983-3004.