电热恒温培养箱 | 复方中草药饲料添加剂发酵工艺研究

目前，我国畜禽养殖业抗生素滥用现象相当严重。虽然抗生素在提高生产效益上发挥了一定的积极作用，但其所导致的负面效应也越来越引起人们的关注。2006年1月1日，欧盟全面禁止抗生素作为饲料添加剂在畜禽养殖中的使用。面对世界各国逐步禁用抗生素饲料添加剂的趋势，我国对绿色饲用抗生素替代品的需求亟待解决。

发酵炮制中草药有着独特的优势。本研究选用马齿苋、黄芪、党参、麦芽、木香等中草药按比例制成复方，用单因素和正交试验相结合的试验设计最终确定其最佳的发酵工艺，其中，发酵微生物为枯草芽孢杆菌，以复方中草药发酵前后多糖含量变化为检测指标，为饲用抗生素替代品的研制提供参考。

PART.1 材料与设备

菌种：枯草芽孢杆菌

试验原料：中草药、酵母膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、蒸馏水、浓硫酸、盐酸、蒽酮及其他试剂均为分析纯

仪器：超净工作台、紫外分光光度计、电热恒温培养箱、可调温水浴锅、超声波提取机、电子天平、电热恒温震荡培养箱、热空气消毒箱。

全钢超净工作台

电热恒温培养箱

可调温水浴锅

电子天平

PART.2 试验方法

●葡萄糖标准曲线的绘制

将样品葡萄糖在105℃烘箱中烘至恒重，使用分析天平称取0.010g于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，得到葡萄糖标准溶液。移液枪分别移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9ml葡萄糖标准溶液至干净具塞试管内，加蒸馏水至1ml。各试管加入硫酸蒽铜溶液（0.1g蒽酮溶于100ml80%浓硫酸中）4ml，沸水中加热10min，冷却至室温。分光光度计在625nm测其吸光度。对所得值进行线性回归，得到回归方程：y=83.93x+0.011，R2=0.998。

●含糖量的测定

中草药在烘箱中烘干后，粉碎，过60目筛，按比例配成27.5g放入250ml三角瓶中用玻璃棒搅拌均匀，在无菌操作台中紫外照射30min。取三角瓶中中草药粉末0.5g放入250ml三角瓶中，加入45ml80%乙醇浸泡30min，超声30min，用加有滤纸的漏斗过滤弃去滤液。过滤后中草药残渣再次放入250ml三角瓶中，重复上述操作1次。将滤渣放入烘箱中烘干，加入2%盐酸，沸水浴1h，冷却至室温后过滤到100ml容量瓶中，重复操作1次，合并滤液，用2%盐酸定容。混匀，取1ml中草药提取液于25ml容量瓶中，用2%盐酸定容，取1ml于具塞试管中，加入4ml硫酸蒽酮溶液，沸水浴10min,凉水冷却至室温，分光光度计625nm下测定吸光度。得到未发酵复方中草药含糖量为10.05%。

●菌种的活化

取适量菌粉于灭菌生理盐水中，在无菌操作台里浸泡24h后，接种到装有枯草芽孢杆菌液体培养基的三角瓶里。放置到电热恒温震荡培养箱，37℃，培养48h。培养两代后，对枯草芽孢杆菌进行平板计数，比较该菌正常活菌数（30亿/g），来决定复壮次数。

●复方中草药的发酵

5种中草药进行粉碎后过60目筛。取复方中草药粉末27.5g入250ml三角瓶，在无菌操作台中紫外灭菌30min，按比例加入菌液、灭菌蒸馏水，用封口膜封好，在设定温度下培养，筛选最适接菌量、料水比、时间、温度，再进行正交试验。

PART.3 实验操作

●料水比对复方中草药发酵的影响

每份称取复方中草药粉末27.5g，入250ml三角瓶，每组3个重复。料水比分别为10.5，10.6，1：0.7，10.8，10.9，1：1，接菌量4%，培养时间72h，培养温度37℃，入电热恒温培养箱中培养。发酵后放入烘箱中烘干，粉碎过60目筛后每份取0.5g样品如1.2.2节方法测发酵药物的多糖含量，确定最佳料水比。

●接菌量对复方中草药发酵的影响

每份称取复方中草药粉末27.5g，入250ml三角瓶，每组3个重复。接菌量分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%，料水比由1.2.5节确定，培养时间72h，培养温度37℃，入电热恒温培养箱中培养。发酵后放入烘箱中烘干，粉碎过60目筛后每份取0.5g样品如1.2.2节方法测发酵药物的多糖含量，确定最佳发酵接菌量。

●培养时间对复方中草药发酵的影响

每份称取复方中草药粉末27.5g，入250ml三角瓶，每组3个重复。发酵时间分别为24、48、72、96、120、144h，料水比由1.2.5节确定，接菌量由1.2.6节确定，培养温度37℃，入电热恒温培养箱中培养。发酵后放入烘箱中烘干，粉碎过60目筛后每份取0.5g样品如1.2.2方法测发酵药物的多糖含量，确定最佳发酵时间。

●培养温度对复方中草药发酵的影响

每份称取复方中草药粉末27.5g，入250ml三角瓶，每组3个重复。培养温度为分别为29、31、33、35、37、39℃，料水比由1.2.5节确定，接菌量由1.2.6节确定，时间由1.2.7节确定，入电热恒温培养箱中培养。发酵后放入烘箱中烘干，粉碎过60目筛后每份取0.5g样品如1.2.2节方法测定发酵药物的多糖含量，确定最佳发酵温度。

●正交试验优化复方中草药的发酵条件

在单因素试验条件下确定适合复方中草药发酵接菌量、料水比、温度、时间的最适值，在此基础上进行四因素三水平的正交试验，发酵后放入烘箱中烘干，粉碎过60目筛后每份取0.5g样品如1.2.2节方法测发酵药物的多糖含量，确定最佳发酵方案。

PART.4 结果与分析

●料水比对复方中草药发酵的影响

料水比为10.5，10.6时，药物发酵后多糖含量逐渐增加，料水比10.6时多糖含量最高，之后多糖含量随着水分的增加而减少，料水比为1：1时，发酵药物多糖含量下降幅度较大。单因素条件下10.6为药物发酵最佳料水比。

●接菌量对复方中草药发酵的影响

接菌量为2%、4%、6%时发酵后药物多糖含量逐渐升高，接菌量为6%、8%、10%、12%时发酵后药物多糖含量逐渐降低。在单因素条件下6%为药物发酵最佳接菌量。

●时间对复方中草药发酵的影响

培养时间在24~48h范围内，发酵药物多糖含量快速上升，培养时间在48~144h范围内，发酵药物多糖含量逐渐降低。单因素条件下48h为药物发酵最佳时间。

●温度对复方中草药发酵的影响

温度在29~35℃范围内，发酵药物多糖含量逐渐升高，35~39℃范围内药物多糖含量逐渐下降。单因素条件下，35℃为药物发酵最佳温度。

●正交试验优化复方中草药的发酵条件

4个因素对发酵后复方中草药多糖含量影响的主次顺序为：D（温度）>C（时间）>A（料水比）>B（接菌量），可知发酵工艺条件最佳组合为A1B1C2D3。方差分析结果表明D(温度)、C（时间）对发酵试验结果的影响极显著(P0.05）。发酵复方中草药（马齿苋、黄芪、党参、麦芽、木香）的最佳工艺组合为：料水比10.5，接菌量4%，时间48h，温度37℃。此条件下发酵的复方中草药多糖含量为17.98%。

PART.5 仪器介绍