降本增效｜汉赞迪自动化解决方案助力单抗药开发

背景介绍

       抗体药物是全球生物药领域中增长最快的细分领域之一，FDA批准上市的抗体药物已超100种。单克隆抗体药物在临床治疗、体外诊断等医学领域应用更加广泛，适应症不断扩大，特异性、均一性、靶向性不断完善。抗体类药物凭借有效、精准、个性化的优势，已经迅速成为全球制药开发的热点。同样，抗体筛选技术也在不断突破发展，先后出现了杂交瘤单克隆抗体技术、抗体库展示技术、单B细胞克隆技术等。

       然而三种抗体筛选技术路线在筛选出特异性强和亲和力高的抗体之前都面临着工作量大、周期长的困境，在竞争激烈的抗体药物开发赛道下，对于药企来说时间成本是最为看重的，上海汉赞迪是国内为数不多的自动化设备制造商之一，可提供多种类型设备和自动化解决方案助力抗体药物开发。

抗体筛选技术路线

       目前抗体筛选技术大致可分为三类，杂交瘤技术，包括小鼠、大鼠、仓鼠和家兔等杂交瘤技术；抗体库技术，包括噬菌体展示抗体库、无细胞分子展示抗体库（核糖体展示、mRNA展示和DNA展示抗体库）和细胞表面展示抗体库（细菌表面展示、真菌表面展示、酵母表面展示和哺乳动物细胞表面展示）、单B细胞克隆三大类，如图1所示。

图1 抗体筛选方式及流程示意图

杂交瘤技术以小鼠杂交瘤最为常用，体外抗体库展示技术以噬菌体为代表，以下介绍三种技术路线的详细流程：

01小鼠杂交瘤制备

图2 小鼠杂交瘤制备单克隆抗体流程

详细流程：

1. 小鼠经免疫全部完成后，在无菌条件下去除脾脏，并完成脾淋巴细胞的制备

2. 选择与免疫动物相同品系的骨髓瘤细胞进行体外培养‍‍

3. 将两种细胞按一定比例混合后加入PEG进行融合

4. 放入HAT培养基中进行培养，去除未融合的细胞、融合的B淋巴细胞、融合的瘤细胞，仅保留杂交瘤细胞

5. 利用特定的方法如ELISA等，筛选能产生抗体的杂交瘤细胞

6. 进行杂交瘤细胞单克隆化已确保得到分泌抗体稳定且完全同质的单克隆，如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。最常用的为有限稀释法，如按0.5个细胞/孔进行铺板，尽可能保证每个孔能生长的为单个细胞，通常需要经过2-3轮单克隆化

7. 利用特定的方法如ELISA、流式细胞法、功能实验等，筛选能产生与所需抗原结合的抗体的杂交瘤单克隆细胞

8. 杂交瘤单克隆细胞冻存可用于后续生产鼠源抗体，包括腹水法或体内培养法

9. 另一方面，需对目标杂交瘤细胞所表达的抗体经常测序鉴定，以便于进一步研究优化，即图2右侧展示的流程:

a. 抽提杂交瘤单克隆细胞中的总mDNA；

b. 反转录获得cDNA；

c. 以cDNA为模板，进行PCR扩增得到重链和轻链片段；

d. PCR产物进行TA克隆构建到表达载体里；

e. 将载体进行测序，得到DNA序列，并翻译成氨基酸序列，得到抗体的全长序列；

f. 同时载体可进一步转染至相应细胞内用于生产相应抗体。

       在整个杂交瘤抗体制备过程中，小鼠免疫后进行血清抗体效价检测（ELISA），融合后进行亲和力初筛（ELISA），单个杂交瘤细胞筛选（有限稀释法或FCM），单克隆抗体功能实验（ADCC/CDC等）以及后续需要进行的提取和质粒构建实验都有着重复性操作、工作量大和人为操作误差等问题，汉赞迪的实验室自动化工作站，可以整合离心机、酶标仪、洗板机、细胞成像仪等各类设备完成自动化、高通量各实验模块的工作，大大提高实验效率和结果一致性。

02噬菌体展示技术

图3 噬菌体展示技术制备抗体流程

详细流程

1. 进行动物免疫：若使用天然库或合成文库则此步骤不需要进行

2. 血清效价测定：若使用天然库或合成文库则此步骤不需要进行

3. 淋巴细胞的分离纯化

4. 总mRNA的提取     

5. 第一链cDNA反转录合成及轻链、重链可变区（scFV DNA）扩增

6. scFV DNA和噬菌体载体酶切、连接（重组质粒构建）

7. 转染大肠杆菌，重组噬菌体制备

8. 库容量的滴定

9. 噬菌体抗体库淘选

10. 获取特异性和亲和力较高的抗体序列

11. 建表达载体和筛选稳定高表达细胞株

         噬菌体文库构建过程中，血清抗体效价检测（ELISA），RNA提取，PCR体系构建、质粒构建后纯化（磁珠法）、库容量的滴定（梯度稀释），噬菌体淘选（ELISA或磁珠）、特异性和亲和力测定中板复制、液体转移等，后续工程菌株构建中表达载体构建、表达产物检测、单细胞分离都有着工作量大、人为易失误等问题，汉赞迪的实验室自动化设备，既可以单机使用解决实验中繁琐和耗时的步骤也可以整合各种模块自动化、高通量完成实验流程，可极大提升实验效率。

03单B细胞克隆技术

图4 单B细胞制备抗体流程

详细流程

1. 从免疫的动物或人体获取外周血单个核细胞

2. 进行抗原特异性结合B细胞分选

3. 单细胞PCR技术扩增lgG抗体重链和轻链可变区基因

4. 质粒构建和转染

5. 表达、筛选抗原特异性抗体

     单个B细胞克隆技术，用流式细胞仪进行单个B细胞分选需进行实验体系制备，抗体序列克隆构建重组质粒，工程菌株生产的抗体进行筛选（ELISA）使用以移液工作站为核心的自动化设备完成高重复性的实验步骤，可加快实验进程并获得可重复性的结果。

       此外，汉赞迪也在单克隆抗体药质控阶段提供相应自动化方案，在抗体生产中，经各种纯化工艺得到的抗体原料药必须符合特定的要求和期望的规格，抗体原料药的规范也有助于设计净化过程，确认最终生产工艺，因此对不同纯化阶段，不同批次的抗体药的质控包括效能、宿主蛋白残留检测、蛋白A残留检测、宿主核酸残留检测、内毒素检测、微生物限度检测势在必行，而移液工作站通过整合不同功能模块的自动化检测系统能够高效的、标准化的完成对抗体药的质控。

汉赞迪抗体筛选实验自动化

解决方案

       众所周知，生命科学实验室普遍面临着实验耗时长、通量低、效率低、稳定性差、安全隐患、数据追踪性差等问题，而流程自动化可大大降低或避免上述问题，汉赞迪在单模块形式自动化、工作站形式自动化、管线形式自动化以及机器人形式智能化等不同自动化程度均有相应的解决方案。

▼ NEMO E9 移液工作站

图5 PCR体系构建NEMO E9移液工作站及台面布局

       NEMO E9是一款灵活、高性能、高通量的自动化移液工作站，共有9个板位，体积小巧，节省空间，可放于通风橱、生物安全柜、超净工作台内；96通道移液头，可有效应用于孔板间的复制、样本或试剂的分装、转移、稀释等实验操作，非常适用于展示库和单B细胞抗体筛选过程中抗体DNA可变区序列大批量扩增体系构建，可将实验人员从大批量、重复移液的实验中解放出来。

▼ 全自动化酶联免疫吸附检测平台

图6 全自动化酶联免疫吸附检测平台

       全自动化酶联免疫吸附平台以高通量移液工作站为核心在其周边整合酶标仪、洗板机和孵育室可实现无人值守、全自动完成ELISA实验流程，可大大提高检测的通量和结果的一致性，也可通过协作机器人再整合上储板栈进一步提升通量，加快阳性抗体的筛选速度。

▼ 高通量蛋白质药物发现和筛选平台

图7 高通量蛋白质药物发现和筛选平台

      高通量蛋白质药物发现和筛选平台是以大肠杆菌和酵母作为宿主细胞表达蛋白药物的筛选和鉴定的全流程自动化解决方案，其实现了菌种的单克隆化，培养，离心及后续的高通量分子、蛋白表达及亲和力的鉴定，具有样本跟踪和数据追溯的功能，实现无人化值守，是蛋白药物研究和发现的加速器。

小结

      目前治疗性单克隆抗体药物已经成为生物制药中增长最快的领域，单抗药物是制药企业全球药物研发布局的重要一环，国内外多个药企已介入其中，而药物研发的速度决定企业是否能占得先机，以移液工作站为核心的自动化设备可加速药物研发的进程，助力药企抗体药开发。