色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。色谱类型根据分离机理的不同，色谱可分为五种类型：吸附、分布、交换、排阻和亲和。色谱分离方法包括吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱、亲和色谱和尺寸排阻色谱。几种色谱分离技术的比较亲和色谱亲和色谱是色谱分离技术的一个重要分支。它是一种液相色谱方法，利用固定相的结合特性吸附目标产物并实现分离和纯化。例如，酶和基质（或抑制剂）、抗原和抗体、激素和受体、外源凝集素和核酸碱基对等之间的特异相互作用，等可形成一种具有不溶性载体的相互作用物质，均可用作色谱固定相。然后可以从复杂的混合物中可逆地拦截另一方，以达到纯化的目的。亲和层析已广泛应用于生物分子的分离和纯化，是分离纯化结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸、多糖等生物大分子的重要方法之一。尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱（SEC）也称为凝胶色谱，利用分子筛使大小和数量不同的分子，根据各组分的排阻能力不同完成组分的分离。小分子量化合物可进入孔中并具有较长的停留时间，而大分子量化合物被阻止进入孔中，继续随流动相流动。当洗脱液为水溶液或缓冲液时，称为凝胶过滤色谱（GFC），在生物学领域应用广泛；当使用有机溶剂作为洗脱液时，称为凝胶渗透色谱（GPC），被广泛用于高分子领域。尺寸排阻色谱通常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质和核酸。凝胶过滤色谱基于蛋白质分子量或分子形状的差异对样品进行分离。当样品从色谱柱顶部向下移动时，大的蛋白质分子无法进入凝胶颗粒并被快速洗脱；而较小的蛋白质分子可以进入凝胶颗粒，并且较小的蛋白质进入凝胶的保留时间不同。分子量越大，洗脱时间越早，从而使具有不同分子大小的蛋白质被分离。键合相色谱根据分离组分在流动相和固定相中的溶解度不同，对样品进行分离。该方法使用一种特殊的液体物质涂覆载体表面，或与载体表面化学键合以形成固定相。涂覆固定（第一种操作方法）现在很少使用，化学键合固定相如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱，在工业上常用。根据固定相和流动相的类型，液相色谱可分为正相色谱（NPC）和反相色谱（RPC）。随着柱填料的快速发展，反相色谱的应用范围逐渐扩大，现已应用于分析一些非极性样品或易分离的样品。吸附色谱吸附色谱法使用固体吸附剂分离混合物中的组分，常用的吸附剂是硅胶或氧化铝。该方法基于固定的相对组分吸附力的大小来分离各组分。整个过程取决于吸附-解吸的平衡。这种分离方法适用于分离分子量为200-1000的异构体以及非离子化合物。局限性是离子化合物的分离容易拖尾。

色谱进样针虽小但却不能缺少，进样针是连接样品和分析仪器的渠道，有了进样针，样品才能进入色谱柱，经检测器，进行连续谱图分析，所以，进样针的维护和清洗是分析人员日常需要关注的重点，否则不仅会影响工作效率，还会对仪器产生伤害，今天，小编给大家整理了主要关于色谱进样针的维护方法步骤和日常使用Tips。进样针的清洗1.可以用有机溶剂来清洗进样针的内壁，在进行清洗时请注意检查进样针推杆是否可以平滑地移动;2.如果在进样针推杆不以平滑的移动，则可以将推杆取出.推荐使用蘸过有机溶剂的软布将其擦干净;3.重复使用有机溶剂抽吸，如果在几次抽吸之后对进样针推杆的阻力很快的增加了，说明仍然有一些小的污物存在，发生这种情况后需重复进行清洗过程。4.如果进样针推杆可以流畅的平稳的移动，检查针头是否堵塞。用有机溶剂重复冲洗针头，检查样品被推出针头的形态。5.如果进样针正常的话样品将会以一条直线流出,如果针头有堵塞的话样品将会从一个方向或一个角度以细雾的形态喷出.即使有时溶剂以直线流出,也要小心检查看流出的情况要好于正常情况(和一个新的未堵塞的进样针比较一下流出情况即可)。6.针头中的堵塞会破坏分析的重现性, 由于这个原因针头的维护是很必要的。用例如金属丝的东西除去针头中的堵塞物. 只有在样品正常流出的情况下才可以使用针头。使用吸液器吸液或者注射器清洁器也可以有效地除去针管内的污染物。进样针的使用注意事项气相色谱进样应该注意的问题手不要拿注射器的针头和有样品部位、不要有气泡(吸样时要慢、快速排出再慢吸，反复几次，10 μl注射器金属针头部分体积0.6μl，有气泡也看不到，多吸1-2μl把注射器针尖朝上气泡上走到顶部再推动针杆排除气泡，(指10μl注射器，带芯子注射器平感觉)进样速度要快(但不易特快)，每次进样保持相同速度，针尖到汽化室中部开始注射样品。怎样防止进样针不弯很多做色谱分析工作的新手常常会把注射器的针头和注射器杆弄弯，原因是：1.进样口拧的太紧，室温下拧的太紧当汽化室温度升高时硅胶密封垫膨胀后会更紧，这时注射器很难扎进去。2.位置找不好针扎在进样口金属部位。3.注射器杆弯是进样时用力太猛，进口色谱带一个进样器架，用进样器架进样就不会把注射器杆弄弯。4.因为注射器内壁有污染，注射时将针杆推弯。注射器用一段时间就会发现针管内靠近顶部有一小段黑的东西，这时吸样注射感到吃力。清洗方法将针杆拔出，注入一点水，将针杆插到有污染的位置反复推拉，一次不行再注入水直到将污染物弄掉，这时你会看到注射器内的水变的浑浊，将针杆拔出用滤纸擦一下，再用酒精洗几次。分析的样品为溶剂溶解的固体样时，进完样要及时用溶剂洗注射器。5.进样时一定要稳重，急于求快会把注射器弄弯的，只要你进样熟练了自然就快了。针式进样器的使用及维护(5 -500uL )1.根据样品的体积选择进样器：为保证精确度，每次进样的体积都不应小于进样器总体积的10%。2.进样器的使用：在使用前检查进样器，检查针筒是否有裂缝及针尖是否是毛口，排除进样器中残留的样品，用溶剂洗涤进样器5～20次，并弃去前2～3次的废液。3.排除进样器中的气泡，把针头浸没于溶剂中，反复的抽排样品。当排除样品时，进样器中的气泡能随着管的垂直变化而改变。4.使用进样器时，先将进样器吸满液体，再排除液体至所需进样的体积。5.进样器的清洗：通常所用的清洗试剂是根据污染物选择的，一般甲醇、二氯甲烷、乙腈和丙酮是常用的。清洗时不能堵塞针头，抽出柱塞，用另一个进样器把清洗溶剂注入，再插入柱塞柔和的把溶剂从针中推出。6.消毒模式：用高压灭菌器消毒时必须把柱塞抽出。不能把整个进样器都浸泡在溶剂中，这样容易破坏进样器上键合部分的粘着性。清洗外部时用绵纸或薄纸。7.柱塞的维护：不能用力压柱塞。当针头被堵时，不能用力压迫柱塞，因为高压能使得柱筒破裂。标准进样器的柱塞时不能相互调换的，每个柱塞都适合相应的进样器上的附着层。当进样器干的时候尽量不要抽压柱塞。进针技巧TIPs1.扎针时感觉进样垫较紧, 则注样后拔针可快;若扎针时感觉进样垫较松, 则注样后拔针可慢点;一般教学时要求三快;但熟练后自己掌握。2.马上拔出。。。进样量要少，可以保证峰形好看些。注意进样器中不要留有气泡，慢吸，快打，将气泡排出;3.进样前多抽吸几次排尽气泡，进样时快进快出，针扎进去的位置去的位置尽量固定，至于进样后按start时间，不需要特别快，只要保证你每次扎完按start的时间间隔一致就可以;4.动作要干净利落，不能迟疑停顿。进样时快进快出，最好保证你每次扎完后立即按start启动数据采集，这样可以保证保留时间的尽可能一致;5.两者都可以，只是同一批次需要采用同一种方式尽可能的保证进样均衡。有一种说法认为进样后即刻拔出来可以起到一种类似搅拌的作用，在进样器内使样品汽化更均匀，可以降低分流歧视效应;6.一般是要立刻拔出，有种说法是针扎入进样垫时会降低密封性引入一些空气杂质，根据分析样品的不同，进样慢还会造成拖尾，另外同一批样品最好由同一个人来进以保证进样的重现性，不同的人进样误差会差别很大，据agilent工程师说，能保证5%以内的误差率就算是比较好的了，原装的进样针非常贵，要小心。7.待测液应装在密封进样瓶中(有些需要避光保存)，以免溶剂挥发导致两次进样间溶液浓度变化。8.进样前，要用溶剂洗进样针三次左右，保证没有上次进样残留。 用待测液洗涤进样针三次左右，保证进样浓度和待测液浓度一致。9.注意赶走进样针中的气泡，以免实际进样量和标示值有偏差。进样手法要一致，速度要快。橡皮圈要勤检查，以免老化。进针时要对准进样器的孔中心，避免在进针过程中碰到进样器的导管;进针快、进样快、拔针快;做液相实验进样针被氧化变涩了，影响进样，要怎么处理呢?1.多数人建议甲醇冲洗，超声20分钟，再用纯甲醇超声试试，一般建议你用完之后用甲醇水清新，然后再用纯甲醇洗，那样针一般不会涩了，我曾经用肥皂水洗过里面的那层油状物。2.还可用5%稀硝酸洗的，因为样品有的时候不是纯甲醇溶解，是用甲醇和水，这样的话进样针上的铁的部分就生锈，用稀硝酸洗的话可以洗掉铁锈。

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什么是气相色谱、液相色谱？气相色谱法是一种以气相为流动相的色谱方法。样品流经气体系统并被气化，最后进入充满填充物的色谱柱以实现有效分离。气相色谱法具有高灵敏度、样品用量少、分离能力强、选择性好、应用范围广、分析速度快等优点。液相色谱法使用填充层、纸和薄板作为固定相。液相色谱在室温下操作，不需要考虑在物质分离过程中样品挥发性和热稳定性的影响。因此，液相色谱可用于分离和分析高热敏性、难汽化和非挥发性物质。根据其分离原理，液相色谱可分为四种类型：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱。液相色谱法的工作原理与经典液相色谱法类似，主要区别在于填充颗粒的大小。液相色谱法主要用于分离分子量大、沸点高和不同极性的有机化合物。由于运输流动相需要高压，因此液相色谱也被称为高压液相色谱。怎么读取气相色谱谱图和液相色谱谱图？气相色谱谱图和液相色谱谱图可以用相同的方法解析。检测器输出的数据为线形图，检测到的化合物数随时间不同而变化。挥发性的化合物的峰首先出现在图表上。图中随后出现的峰表示混合物的挥发性逐渐降低。研究人员可以使用这些色谱图进一步分解样品中混合物的化学性质。峰尺寸的比例与样品中物质的含量有关。峰下的面积用于确定样本大小。例如，要确定样品中的成分，首先需要分析已知浓度的标准样品，将标准品色谱图上的保留时间和峰面积与测试样品进行比较，获得样品中的目标化合物浓度。气相色谱和液相色谱工作流程在气相色谱中，样品溶液进入蒸发室后，由载气(载气通常为氮气或氦气)输送进入色谱柱。在色谱柱中分离出不同的成分，最后流出色谱柱。柱中的活动由检测器进行检测。每个成分逐一检测之后，记录器、积分器或数据处理系统会记录下这些色谱信号。在液相色谱中，液相流动相流经输液泵，与样品溶液混合，最后流出色谱柱。吸附分离在柱中进行。在色谱检测站，检测器最终将所有成分转换成电信号，或相应的样品峰。气相色谱和液相色谱的应用气相色谱可用于手性化合物的化学分离实验、对羟基苯甲酸酯食品防腐剂中对羟基苯甲酸酯的分离与测定、各种农药的分离、血浆中掺杂的检测以及环境污染物化学成分的检测等多方面研究。液相色谱法在食品检测，例如食品中有毒有害物质、微生物产品、营养物和添加剂的检测、环境中农药污染的潜在生物标志物的研究以及血浆和尿液中毒素的测定等。

人类进入21世纪,科学技术高度发展,先进的分析仪器不断涌现,每一类分析仪器在一定范围内起作用,并且要求在一定的条件下使用。如色谱作为一种分析方法,其最大特点在于能将一个复杂的混合物分离为各自单一组分,但它的定性、确定结构的能力较差,而质谱(MS)、红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、等离子体发射光谱(ICP—AES)和核磁共振波谱(NMR) 等技术对一个纯组分的结构确定变得较容易。因此,只有将色谱、 固相(微)萃取、膜分离等分离技术与质谱等鉴定、检测仪器联用才能得到一个完整的分析,取得丰富的信息与准确的结果。分析仪器联用技术已在全行业样品分析中得到应用,并有广阔的发展前景。随着新物质不断出现,以及科技的进步,对分析工具的技术要求更高,仪器联用将发挥重要的作用。1色谱—色谱联用技术样品组分较简单时,通常用一根色谱柱,一种分离模式即可以得到很好的分离,但对于某些较复杂的组分,无论如何优化色谱条件、参数也无法使其中一些组分得到较好的分离,这时可采用色谱—色谱联用技术。色谱—色谱联用 技术也称为多维色谱。气相色谱—气相色谱(GC—GC)联用该联用技术已有30多年的历史,在工业分析中得到广泛的应用,GC—GC联用仪已商品化。如采用SE-52毛细管柱分析柠檬油时,采用二级GC联用能将化合物的对映异构体得到很好分离。液相色谱—液相色谱(LC—LC)联用Hube于20世纪70年代提出LC—LC联 用,技术的关键是柱切换,通过改变色谱柱与色谱柱、进样器与色谱柱、色谱柱与检测器之间的连接,以改变流动相的流向,实现样品的分离、净化、富集、制备和检测。液相色谱有多种分离模式,可以灵活选用分离模式的组合,其选择性调节能力远大于GC—GC联用技术,具有更强的分离能力。该接口技术比GC—GC联用的要复杂得多,至今市场上尚未见商品化的LC—LC 联用系统,分析工作者多是自行组装LC—LC系统,适用于特定组分的分离和分析。其他联用技术LC—LC联用主要用于解决GC分析中和 某些复杂样品分离时,基体组成复杂,不能直接进行GC分离与检测的难题。通过高效液相色谱(HPLC)高效的分离技术与GC高灵敏度的检测技术联用,提高方法的灵敏度和分辨率;超临界 流体色谱—超临界流体色谱(SFC—SFC)及 SFC—LC、SFC—CEC(毛细管电泳)等连用是20 世纪90年代中后期发展起来的联用技术,广泛用于复杂样品中如食品、生物样品、煤焦油等有机化合物、异构体、多环芳烃、生物大分子(如多肽、蛋白、核酸等)的分离分析,具有多种分离模式可 供选择,以及具有较高的柱效和分析灵敏度 。2色谱—原子光谱联用技术原子光谱仪器对于金属元素及部分非金属元素分析,具有简单、 快速、准确、灵敏的特点。如原子荧光对As、Se、Sn、Sb、Hg等元素有非常高的灵敏度;等离子体光谱(I CP)使多元素同时测定成为可能,极大地促进了元素分析的发展与进步。以色谱为分离手段的各种联用技术不断推出,在元素化学形态分析中发挥重要作用。 Kolb等人于1966年首先提出原子吸收可 作为气相色谱的金属检测器,并测定了汽油中的烷基铅。石英炉原子化器作为色谱的检测器灵敏度高,石墨炉原子化器已广泛作为与气相色谱、高效液相色谱、离子色谱 (IC)等连用的检测器,鉴别和测定大气、 水样、生物等样品中的烷基铅、烷基砷、烷基硒、有机锰、有机锡,以及某些元素在自然界和生物体中的分布。但这些联用技术很少商品化,更多是分析者根据需要利用仪器的性能选择性地联用,解决实 际问题。这种系统干扰少、灵敏度高,仅适合于易形成挥发性共价氢化物的元素测定。 石墨炉原子吸收作为色谱的检测器成本和连接技术要求较高,火焰原子吸收检测器操作 容易,成本低,连接简单。 HPLC—AAS用于复杂基体样品如海水中金属元素、价态分析。液相色谱—原子荧光光谱(HPLC—AFS)用于海产品中无机和有机Hg形态分析,灵敏度较高。3离子色谱联用技术ICP—AES具有快速、简便、检出限低、灵敏度和精密度高、线形范围宽、稳定性好、选择性好、基本效应小且可以有效校正、可同时进行多元素分析、易于实现分 析自动化等特点。I CP—AES法测定Al、Zn、Ba、Be、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Na、K、Mg、Ni、Pb、Sr、Ti、 V、Mn、As已在环境监测中得到广泛应用。I CP—MS具有谱线简单、分析速度快、灵敏度和精密度高、检出限低、线形范围宽、干扰少、可进行同位素比值测定、同时测定多种微量元素而不必预分离富集等特点。日本和美国 都已把用I CP—MS分析水中Cr(Ⅵ)、Cu、Cd和Pb列为标准方法。用HPLC—ICP—MS和IC—ICP—MS进行尿液中各种形态As的分析,以及ICP—MS在新型材料学、医学和药学等分析领域的应用都有报道。用高分辨率I CP—MS还可直接进行痕量稀土元素定量分析。目前I CP—AES和ICP—MS已广泛应用于环境保护、水质检测、新型材料、生物医学药学、石化、地理、地质、冶金、半导体、化学探矿、商品检验、刑侦等领域,是环境分析领域中进行常量、痕量和痕量分析的主要手段之一。随着科学 技术的迅猛发展和环境分析需求的扩展,ICP—AES和ICP—MS技术正向着全面化和智能化 的方向发展。4色谱—质谱联用技术气相色谱—质谱(GC—MS)联用GC—MS联用,其GC部分用来分离多组分 的混合污染物,而MS部分则对各组分进行分 析。GC和MS联用技术得到快速发展,是联用技术中最完善、应用的技术,最早实现商品化。目前市售的有机质谱仪、磁质谱、四极杆质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱(TOF)、傅立叶变换质谱(FTMS)等均能与气相色谱联用。GC—MS联用在分析检测和科研的许多领域起着重要作用,特别是在许多有机化合物常规检测工作中成为一种工具。在环保、卫生、食品、农业、石油、化工等行业得到广泛应 用。如环境中有机污染物、二恶口英、DDT、六六 六、多氯联苯检测、水质及食品中的有机污染物、农药分析、化学毒剂检测等方面都有大量的报道。液相色谱—质谱(LC—MS)联用GC与GC—MS只能分析检测20%有机物,70%~80%有机物分析要采用LC、IC、LC—MS等 检测。由于GC柱分离后的样品呈气态,流动相是气体,与质谱的进样系统相匹配,最容易将2种仪器联用,而HPLC流动相是液体,不能直接进入质谱分析,因此接口技术更高,联用技术发展比较慢,直到20世纪80年代,才有成熟的商品LC—MS推出。气相色谱—电感偶合等离子体质谱(GC—ICP—MS)联用目前开发的用 ICP—MS联机仪器作为GC的检测器测量痕量和超痕量有机金属污染物。I CP—MS作为GC的检测器可测定10-6级的金属元素,如Cr6+、Cu、Cd、Pb、Hg、Ti、Ba、Be、Ni、 Mn、As等,选择不同质量数进行测定,还能大大提高其选择性,即使GC不能把干扰成分分离,也不会对 ICP—MS的测定产生影响。 GC—ICP—MS的装置是通过接口将GC与ICP—MS相连接,用GC将待测成分分离后,用ICP—MS得到测定元素的有关信息。目前应用GC—ICP—MS技术测定有机锡、有机汞以及铅、锑、砷、硒 等有机污染物的技术和方法正在开发研究中。5色谱—傅立叶变换红外光谱联用色谱相当于分离装置,红外光谱仪相当于定性检测器,联合使用,起到结合,能兼有2种仪器的功能。 直到60年代后期,随着傅立叶变换红外光谱仪 (FTIR)的出现,扫描速度和灵敏度有很大提高,才使GC与 IR联用成为可能。GC—FTIR系统已在水质、废气等环 境污染分析中得到广泛应用。主要检测多环芳烃、醚类、酯类、酚类、氯苯类、有机酸、有机氯农药、除莠剂和氯代芳香化合物等。液相色谱适合于沸点高、极性强、热稳定性 差、大分子试样的分离,与FTIR联用,可弥补GC—FTIR的不足。由于接口技术尚没有突破,使LC—FTI R仪的应用至今仍难以普及,研究工作有待深入。SFC具有柱效高、分离速度快,兼有GC和LC的优点,SFC—FTIR联用成为联用技术的发展方向之一,目前SFC—FTI R应用不多,有待于开发应用。6色谱—核磁共振波谱(NMR)联用目前该技术还不很成熟,应用较少。HPLC—NMR联用在应用中的主要问题是如何克服流动相产生的巨大的共振信号干扰,以观察到分析化合物的核磁共振信号,一般为了获得较好的HPLC—NMR图谱,要求HPLC柱分离样品量要大些,以提高NMR仪的检测限度。新近出现的LC—NMR联用技术可以直接测定经HPLC分离后的各种化合物一维1H-NMR谱图和“静态"操作下的二维NMR谱图,为鉴定化合物的结构提供了精确的、重要的在线结构信息,被认为是快速鉴定化学成分结构方面的一个重大突破。

气相色谱分析是指流动相为气体的色谱分析法。气体和易于挥发的液体或固体等试样都可用气相色谱分析进行分离和测定。气相色谱分析优势：1、分析速度快。一般只需几分钟到几十分钟便可完成一次分析，如果用色谱工作站控制整个分析过程，自动化程度提高，分析速度更快。2、选择性好。能分离分析性质极为相近的物质，如有机物中的手性物质，顺、反异构体，同位素，芳香烃中的邻、间、对位异构体、对映体积组成极复杂的混合物，如石油、污染水样和天然精油等。3、分离效能高。在较短时间内能够同时分离和测定极为复杂的混合物。例如，用空心毛细管柱能一次分析样品中的150个组分。4、灵敏度高。可以分析～g的物质，可以检测出超纯气体、高分子单体和高纯试剂等数量级在。数量级的杂质，非常适合于微量和痕量分析。5、应用范围广。可以分析气体、易挥发的液体和固体，包含在固体之中的气体。通常，只要沸点在500℃以下，且在操作条件下热稳定性良好的物质，理论上均可以采用气相色谱技术进行分析。对于受热易分解或挥发性低的物质，通过化学衍生的方法使其转化为热稳定性或高挥发性的衍生物，同样可以实现气相色谱的分离和分析。

01、流动相GC用气体作流动相，又叫载气。常用的载气有氦气、氮气和氢气。与HPLC相比，GC流动相的种类少，可选择范围小，载气的主要作用是将样品带入GC系统进行分离，其本身对分离结果的影响很有限。而在HPLC中，流动相种类多，且对分离结果的贡献很大。换一个角度看，GC的操作参数优化相对HPLC要简单一些。此外，GC载气的成本要低于HPLC流动相的成本。02、固定相因为GC的载气种类相对少，故其分离选择性主要通过不同的固定相来改变，尤其在填充柱GC中，固定相常由载体和涂敷在其表面的固定液组成，这对分离有决定性的影响，所以，导致了种类繁多的GC固定相的开发研究。迄今已有数百种GC固定相可供我们选择使用，但常用的HPLC固定相也就十几种。故LC在很大程度上要靠选用不同的流动相来改变分离选择性。当然，毛细管GC常用的固定相也不过十几种。在实际分析中，GC一般是选用一种载气，然后通过改变色谱柱(即固定相)以及操作参数(柱温和载气流速等)来优化分离，而LC则往往是选定色谱柱后，通过改变流动相的种类和组成以及操作参数(柱温和流动相流速等)来优化分离。03、分析对象GC所能直接分离的样品是可挥发、且热稳定的，沸点一般不超过500℃。据有关资料统计，在目前已知的化合物中，有20%～25%可用GC直接分析，其余原则上均可用LC分析。也就是说GC的分析对象远没有LC多。需要指出的是，有些虽然不能用GC直接分析的样品，通过特殊的进样技术，如顶空进样和裂解进样，也可用GC间接分析。比如高分子材料的裂解色谱就是如此。这在一定程度上扩大了GC分析对象的范围。此外，GC比LC更适合于气体的分析。04、检测技术GC常用的检测技术有多种，比如热导检测器(TCD)、火焰离子化检测器(FID)、电子俘获检测器(ECD)、氮磷检测器(NPD)等，其中FID对大部分有机化合物均有响应，且灵敏度相当高，最小检测限可达纳克级。而在LC中尚无通用性这么好的高灵敏度检测器。商品LC仪器常配的也就是紫外-可见光吸收检测器(UV-Vis)和示差折光检测器(RI)。前者的通用性远不及GC中的FID，后者的灵敏度又较低，且不适于梯度洗脱。当然，不论GC还是LC，都有一些高灵敏度的选择性检测器，GC有ECD和NPD等，LC有荧光和电化学检测器。较为理想的检测器应该首推MS，但在这一点上，GC目前要优于LC。因为GC流动相的特点，它与MS的在线联用已不存在任何问题，特别是毛细管GC与MS的联用已成为常规分析方法。而LC与MS的联用就受到了流动相的限制。虽然目前已有多种接口，如离子束、热喷雾、电喷雾等，但流动相的选择还是受到明显的限制。

本文共分为了四个部分：色谱法总论、气相色谱法、高效液相色谱、质谱分析法，共涉及了104个色谱分析的相关知识点，由于文章内容较长，故分为上、下两期分享，文章内容都是干货适合收藏反复查阅。色谱法总论1.色谱分析法：色谱法是一种分离分析方法，它利用样品中各组分与流动相和固定相的作用力不同(吸附、分配、交换等性能上的差异)，先将它们分离，后按一定顺序检测各组分及其含量的方法。2.色谱法的分离原理：当混合物随流动相流经色谱柱时，就会与柱中固定相发生作用(溶解、吸附等)，由于混合物中各组分物理化学性质和结构上的差异，与固定相发生作用的大小、强弱不同，在同一推动力作用下，各组分在固定相中的滞留时间不同，从而使混合物中各组分按一定顺序从柱中流出。这种利用各组分在两相中性能上的差异，使混合物中各组分分离的技术，称为色谱法。3.流动相——色谱分离过程中携带组分向前移动的物质。4.固定相——色谱分离过程中不移动的具有吸附活性的固体或是涂渍在载体表面的液体。5.色谱法的特点：(1)分离效率高，复杂混合物，有机同系物、异构体。(2)灵敏度高，可以检测出μg·g-1(10-6)级甚至ng·g-1(10-9)级的物质量。(3)分析速度快，一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。(4)应用范围广，气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。(5)高选择性:对性质极为相似的组分有很强的分离能力。不足之处：被分离组分的定性较为困难。6.色谱分析法的分类：按两相状态分类，按操作形式分类，按分离原理分类。7.按两相状态分类：气相色谱(GasChromatography，GC)；液相色谱(Liquid Chromatography，LC)；超临界流体色谱(Supercritical Fluid Chromatography，SFC)。气相色谱：流动相为气体(称为载气)，常用的气相色谱流动相有N2、H2、He等气体；按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱；液相色谱：流动相为液体(也称为淋洗液)；按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱；超临界流体色谱：流动相为超临界流体，超临界流体是一种介于气体和液体之间的状态。超临界流体色谱法是集气相色谱法和液相色谱法的优势而发展起来的一种新型的色谱分离分析技术，不仅能够分析气相色谱不宜分析的高沸点、低挥发性的试样组分，而且具有比高效液相色谱更快的分析速率和更高的柱效率。8.按操作形式分类：柱色谱(Column Chromatography，CC):固定相装在柱管内，包括：填充柱色谱和毛细管柱色谱。纸色谱(Paper Chromatography, PC)固定相为滤纸；采用适当溶剂使样品在滤纸上展开而进行分离，薄层色谱(Thin Layer Chromatography, TLC)固定相压成或涂成薄层，操作方法同纸色谱。9.按分离原理分类：吸附色谱(Absorption chromatography)；分配色谱(Partition Chromatography)；离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)；凝胶色谱(Gel Chromatography)。10.色谱图：组分在检测器上产生的信号强度对时间(t)所作的图，由于它记录了各组分流出色谱柱的情况，所以，又叫色谱流出曲线，流出曲线的突起部分称为色谱峰。11.色谱保留值：色谱保留值是色谱定性分析的依据，它体现了各待测组分在色谱柱上的滞留情况。在固定相中溶解性能越好，或与固定相的吸附性能越强的组分，在柱中的滞留时间越长，或者说，将组分带出色谱柱所需的流动相体积越大，所以，保留值可以用保留时间和保留体积两套参数来描述。12.色谱图上的色谱流出曲线可以说明什么问题：根据色谱峰的数目，可判断样品中所含组分的最少个数；根据色谱峰的保留值进行定性分析;根据色谱峰的面积或峰高进行定量分析；根据色谱峰的保留值和区域宽度评价色谱柱的分离效能；根据两峰间的距离，可评价固定相及流动相选择是否合适。13.分配比：分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。14.在色谱流出曲线上，两峰之间的距离主要由两组分在两相间的分配系数还是扩散速度决定?为什么?答：分配系数。两峰间的距离由热力学因素决定，两组分在两相中分配系数差异越大，两峰间的距离则相差越大，越容易被分离。而扩散速度是动力学因素，反映在色谱流出曲线上即为色谱峰的区域宽度(形状)。15.色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。16.组分保留时间为何不同?色谱峰为何变宽?组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制，(组分和固定液的结构和性质)。色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制，(两相中的运动阻力，扩散作用)。塔板理论和速率理论分别从热力学和动力学的角度阐述了色谱分离效能及其影响因素。17.半经验理论：将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复(类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程)。18.塔板理论的特点：塔板理论引入了塔板数和塔板高度作为柱效的衡量指标；不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质；柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。19.塔板理论的不足：塔板理论的基本假设不符合色谱柱的实际分离过程。塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的流动相流速下柱效不同的实验结果，不能说明色谱峰为什么会展宽，同时未能指出影响柱效的因素及提高柱效的途径和方法。20.速率方程(也称范第姆特方程式)：H=A+B/u+C·u，H：塔板高度；u：流动相的平均线速度(cm/s)。A.─涡流扩散项：A与流动相性质、流动相速率无关。要减小A值，需要从提高固定相的颗粒细度和均匀性以及填充均匀性来解决。对于空心毛细管柱，A=0。固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑，表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。B/u—分子扩散项：存在着浓度差，产生纵向扩散;扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差；分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑；扩散系数：Dg∝(M载气)-1/2；M载气↑，B值↓。C·u—传质阻力项：dp↓，df↓，D ↑ ,可降低传质阻力。21.H-u曲线与最佳流速：由于，流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即，速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。22.速率理论的要点：组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因；通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效；速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响；各种因素相互制约，如，载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响。选择最佳条件，才能使柱效达到最高。23.色谱定性方法：①与标样对照的方法：利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。②利用文献保留值定性：利用相对保留值r21定性。相对保留值r21仅与柱温和固定相性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定相上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。24.色谱定量分析：①定量校正因子：试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即，mi=fi’·Ai；绝对校正因子：比例系数fi；单位面积对应的物质量：fI ’=mi/Ai，相对校正因子fi：即，组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。②常用的几种定量方法：（1）归一化法：特点及要求：简便、准确；进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大；仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。（2）外标法——标准曲线法：特点及要求：外标法不使用校正因子，准确性较高，操作条件变化对结果准确性影响较大。对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。(3)内标法：内标物要满足以下要求：(a)试样中不含有该物质；(b)与被测组分性质比较接近；(c)不与试样发生化学反应；(d)出峰位置应位于被测组分附近，且能分离开；(e)加入量适中并与待测组分接近。内标法特点：内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大；每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析；若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：wi=Ai/As*常数。气相色谱法1.气相色谱法(GC)：是以气体为流动相的色谱分析法。2.气相色谱要求样品：气化，不适用于大部分沸点高和热不稳定的化合物，对于腐蚀性能和反应性能较强的物质更难于分析。大约有15%～20%的有机物能用气相色谱法进行分析。3.气相色谱仪的组成：气路系统、进样系统、分离系统、检测系统、温控系统、记录系统。4.气路系统：包括气源、净化器和载气流速控制；常用的载气有：氢气、氮气、氦气。5.进样系统：包括：进样装置和气化室，气体进样器(六通阀)：试样首先充满定量管，切入后，载气携带定量管中的试样气体进入分离柱；液体进样器：不同规格的微量注射器，填充柱色谱常用10μL；毛细管色谱常用1μL；新型仪器带有全自动液体进样器，清洗、润冲、取样、进样、换样等过程自动完成，一次可放置数十个试样。6.进样方式：分流进样：样品在汽化室内气化，蒸气大部分经分流管道放空，只有极小一部分被载气导入色谱柱；不分流进样：样品直接注入色谱的汽化室，经过挥发后全部引入色谱柱。7.分离系统：色谱柱：填充柱(2～6mm直径，1～5m长)，毛细管柱(0.1～0.5mm直径,几十米长)。8.温控系统的作用：温度是色谱分离条件的重要选择参数；气化室、色谱柱恒温箱、检测器三部分在色谱仪操作时均需控制温度；气化室：保证液体试样瞬间气化；检测器：保证被分离后的组分通过时不在此冷凝；色谱柱恒温箱：准确控制分离需要的温度。9.检测系统：作用：将色谱分离后的各组分的量转变成可测量的电信号；指标：灵敏度、线性范围、响应速度、结构、通用性，通用型——对所有物质均有响应；专属型——对特定物质有高灵敏响应；检测器类型：浓度型检测器：热导检测器、电子捕获检测器；质量型检测器：氢火焰离子化检测器、火焰光度检测器。10.热导检测器的主要特点：结构简单，稳定性好；对无机物和有机物都有响应，不破坏样品；灵敏度不高。11.氢火焰离子化检测器的特点：优点：(1)典型的质量型检测器；(2)通用型检测器(测含C有机物)；(3)氢焰检测器具有结构简单、稳定性好、灵敏度高、响应迅速、死体积小、线性范围宽等特点；(4)比热导检测器的灵敏度高出近3个数量级，检测下限可达10-12g·g-1；缺点：(1)对载气要求高；(2)检测时要破坏样品，无法回收样品；(3)不能检测永久性气体、水及四氯化碳等。。。12.电子俘获检测器的特点：对卤素、硫、磷、氮、氧有很强的响应；灵敏度高，可用于痕量农药残留物的分析；线性范围较窄。13.火焰光度检测器(FPD)：是一种对含硫、磷化合物具有高选择性的检测器。含硫、磷化合物在富氢火焰中燃烧被打成有机碎片，发出不同波长的特征光谱。14.固定相：固体固定相：固体吸附剂；液体固定相：由载体和固定液组成；聚合物固定相。15.固体固定相：一般为固体吸附剂，常用的有活性炭，硅胶，氧化铝和分子筛。优点：吸附容量大、热稳定性好、价格便宜；缺点：柱效低、吸附活性中心易中毒，使用前要进行活化。应用：主要用于惰性气体、H2、O2、N2、CO、CO2和CH4等一般气体和低沸点物质。16.作为载体使用的物质应满足的条件：表面有微孔结构，孔径均匀，比表面积大；化学和物理惰性，即，与样品组分不起化学反应，无吸附作用或吸附很弱；热稳定性好；有一定的机械强度和浸润性，不易破碎；具有一定的粒度和规则的形状，最好是球形。17.对固定液的要求：在使用温度下是液体，具有较低的挥发性；具有良好的热稳定性；对要分离的各组分应具有合适的分配系数；化学稳定性好，不与样品组分、载气、载体发生任何化学反应。18.固定液的分类：非极性固定液、中等极性固定液、强极性固定液、氢键型固定液。19.非极性固定液：主要是一些饱和烷烃和甲基硅油，它们与待测物质分子之间的作用力以色散力为主。组分按沸点由低到高顺序流出，若样品中兼有极性和非极性组分，则同沸点的极性组分先出峰。常用的固定液有角鲨烷(异三十烷)、阿皮松等。。。适用于非极性和弱极性化合物的分析。20.中等极性固定液：由较大的烷基和少量的极性基团或可以诱导极化的基团组成，它们与待测物质分子间的作用力以色散力和诱导力为主，组分基本上按沸点顺序出峰，同沸点的非极性组分先出峰。常用的固定液有邻苯二甲酸二壬酯、聚酯等，适用于弱极性和中等极性化合物的分析。21.强极性固定液：含有较强的极性基团，它们与待测物质分子间作用力以静电力和诱导力为主，组分按极性由小到大的顺序出峰。常用的固定液有氧二丙腈等，适用于极性化合物的分析。22.氢键型固定液：是强极性固定液中特殊的一类，与待测物质分子间作用力以氢键力为主，组分依形成氢键的难易程度出峰，不易形成氢键的组分先出峰。常用的固定液有聚乙二醇、三乙醇胺等，适用于分析含F、N、O等的化合物。23.固定液的选择：①按极性相似原则选择：极性相似，溶解度大，分配系数大，保留时间长；②按官能团相似选择：酯类——酯或聚酯类固定液；醇类——聚乙二醇固定液。③按主要差别选择：各组分间沸点是主要差别——非极性固定液；极性为主要差别——极性固定液。④选择混合固定液：对于难分离的复杂样品，可选用两种或两种以上固定液。24.聚合物固定相：既可作为固体固定相，也可作为载体，又称高分子多孔微球。物质在其表面既存在吸附作用，又存在溶解作用。(1)具有较大的比表面积，表面孔径均匀；(2)对非极性及极性物质无有害的吸附活性，拖尾现象小，极性组分也能出对称峰；(3)由于不存在液膜，无流失现象，热稳定性好；(4)机械强度和耐腐蚀性较好，系均匀球形，在填充柱色谱中均匀性、重现性好，有助于减少涡流扩散。25.载气种类的选择：检测器的适应性，载气流速的大小。26.柱温的选择：(1)首先应使柱温控制在固定液的最高使用温度(超过该温度固定液易流失)和最低使用温度(低于此温度固定液以固体形式存在)范围之内。(2)提高柱温，可以改善传质阻力，有利于提高柱效，缩短分析时间，但降低了容量因子和选择性，不利于分离。一般的原则是：在使最难分离的组分尽可能分离的前提下，尽量采用较低的柱温，但以保留时间适宜，峰形不拖尾为度。(3)柱温一般选择在接近或略低于组分平均沸点时的温度。(4)组分复杂，沸程宽的试样，采用程序升温。27.载体和固定液含量的选择：配比：固定液在载体上的涂渍量，一般指的是固定液与担体的百分比，填充柱的配比通常在5%～25%之间。配比越低，担体上形成的液膜越薄，传质阻力越小，柱效越高，分析速度也越快。配比较低时，固定相的负载量低，允许的进样量较小。分析工作中通常倾向于使用较低的配比。28.进样条件的选择：进样量应控制在柱容量允许范围及检测器线性检测范围之内，进样要求动作快、时间短，汽化室一般较柱温高30~70°C。29.提高色谱分离能力的途径：(1)塔板理论：增加柱长，减小柱径，即增加柱子塔板数；(2)速率理论：减小组分在柱中的涡流扩散和传质阻力，可降低塔板高度。30.毛细管色谱柱的结构特点：(1) 不装填料阻力小，长度可达百米的毛细管柱，管径0.2mm；(2)气流单途径通过柱子，消除了组分在柱中的涡流扩散；(3)固定液直接涂在管壁上，总柱内壁面积较大,涂层很薄，则气相和液相传质阻力大大降低。(4)毛细管色谱柱柱效高达每米3000～4000块理论塔板，一支长度100米的毛细管柱，总的理论塔板数可达104～106。31.毛细管色谱具有以下优点：(1)分离效率高：比填充柱高10～100倍；(2)分析速度快：用毛细管色谱分析比用填充柱色谱速度；(3)色谱峰窄、峰形对称，较多采用程序升温方式；(4)灵敏度高，一般采用氢焰检测器。(5)涡流扩散为零。32.毛细管色谱的类型：(1)涂壁毛细管柱：将固定液直接涂敷在管内壁上。柱制作相对简单，但柱制备的重现性差、寿命短。(2)多孔层毛细管柱：在管壁上涂敷一层多孔性吸附剂固体微粒，构成毛细管气固色谱。(3)载体涂渍毛细管柱：将非常细的担体微粒粘接在管壁上，再涂固定液。柱效较涂壁毛细管柱高。(4)化学键合或交联毛细管柱：将固定液通过化学反应键合在管壁上或交联在一起。使柱效和柱寿命进一步提高。

液相色谱法是一种广泛应用于制药行业的分析分离技术，制药行业现在几乎完全将 HPLC 用作色谱技术。因为它可以进行高效分离分析，提供所需的精确结果，可用于在生产过程中定量和定性分析成品药及其成分。这是通过混合物中成分的分离、量化和鉴定来实现的，可用于揭示药物的特性并监测疾病治疗的进展。该技术的工作原理是混合物中的成分被不同程度地吸引到固定相的吸附剂表面，这取决于它们各自的极性和结构特征；对固定相具有更高亲和力的组分将比对流动相具有更高亲和力的组分更慢地沿色谱柱向下迁移。HPLC的主要优点之一是它能够阐明结构并确定药物制剂中杂质的数量。HPLC特别适用于不易挥发、热不稳定和高分子量的化合物。因此，它可以量化药物的纯度和剂型。制药工业中使用的其他形式的HPLC包括反相、变性和固定化酶反应器 (IMER) HPLC。但是HPLC的缺点之一就是必须先进行校准测试，这会增加成本。高效液相色谱法简单、特异、快速、精密和准确，可成功有效地用于散装和药物剂型的常规质量控制分析。它也可以与其他分析方法结合使用，以进一步阐明混合物的成分。HPLC-UV使用UV作为一种检测形式。它的好处是不需要通过与传统色谱方法相关的复杂处理和程序，使其更省时且经济。对于成分的检测，二极管阵列和快速扫描检测器可用于峰识别和峰纯度监测。相反，荧光和电化学检测器对合适的分析物更敏感，对许多化合物的选择性也比紫外检测器更高。在液相色谱分离过种程中，特别是在梯度洗脱过程中容易产生莫名其妙的色谱峰，我们俗称鬼峰，鬼峰的来源有很多，其中主要来源于流动相和管路，如：有机相中污染物，水相中污染物，缓冲盐，流动相瓶和混合过程产生等等。鬼峰捕集小柱主要的特点是能够去除溶剂包括有机溶剂中的杂质。反相色谱梯度分析时，将小柱安装在梯度混合器和自动进样器之间，不仅能够去除流动相中的杂质，还可以有效捕集管路和混合器中的杂质。HPLC可以结合的另一种技术是质谱法 (HPLC/MS)。色谱仪通过接口连接到质谱仪，这种分析形式可以检测范围较广泛的样品，包括热不稳定、高极性或具有高分子量的成分。从色谱柱洗脱的组分被引入到专用接口上的质谱仪。用于 HPLC/MS 的两个最常见的接口是电喷雾电离和大气压化学电离接口。液相色谱法是一种高效有用的分析手段，可用于确定药物配方的成分，使研究人员能够量化配方并发现产品中是否存在任何杂质。HPLC 可以与其他技术相结合，能够进一步提高功能，使其成为制药公司确保药物高质量的理想分析技术。

液相色谱仪是分析工作者常用的“一门技术”。何时能将液相做到有“打游戏”感觉时，便是到了游刃有余、驾轻就熟的境界。现今的液相软件均已具备了强大的数据处理功能，如能庖丁解牛般使用，便可将此测定做到事半功倍、轻松自如。一、 水相中的溶质溶解方式水相中需溶解的无机盐和表面活性剂等固体溶质，建议采用加热法，不建议采用振摇、超声等方式。因此种方式的溶解，溶质可能处于“临界胶团浓度”，其后一旦遇到某特殊情形（如遇有机溶剂、温度剧降等），极易析出少量结晶；而一旦析出，便将损伤仪器和色谱柱，呈现泵头处析出“盐和白粉”的现象。二、 流动相的配制与使用1. 恒度洗脱一定是将水相与有机相混合后、抽滤（使用混合型过滤膜），用一个管路（如A管）泵入仪器，这是使用的原则。切勿因节约有机相、便于摸索色谱条件等原因而使用两个管路（一个纯水相、一个纯有机相）泵入仪器，即便配制了脱气机。因此种情形极易造成水相中盐和表面活性剂的少量析出。剩余流动相完全可继续使用，密封后放置阴凉处；待下次试验时与新配制的流动相混合后抽滤即可。无需担心发霉、无机盐析出、挥发、比例不准等问题，这些皆为疑神疑鬼的表现。实践是检验真理的标准！实践吧~2. 梯度洗脱流动相配制最为科学的方式是：A相为高比例的水相-低比例的有机相、B相为低比例的水相-高比例的有机相（英国药典几乎均如此）；其次为：A相为高比例的水相-低比例的有机相、B相为纯有机相；最不科学的为：A相为纯水相、B相为纯有机相，如既有质量标准采用了此种方式，建议改为第二种或第一种方式，否则基线漂移严重，难以进行稳定的杂质检测。梯度洗脱结束后，建议经5分钟回到初始状态，再平衡5分钟后开始下一针测定。这10分钟的稳定极为关键。切勿短时间内回到初始状态，会对仪器和色谱柱损伤较大。三、 色谱柱的安装标准SOP应为：取A管路放入流动相瓶中→拧松泵头→流速由0ml/min逐渐升至10ml/min，观察尾液是否呈瀑布状流出，持续10秒→拧紧泵头→流动相呈抛射状从安装色谱柱的一端喷出，观测是否呈抛物线状，持续5秒→流速逐步降至1.0ml/min →安装色谱柱，待20秒后，流动相从色谱柱另一端呈泉水状涌出再安装另一端→手握两端螺丝帽，拧紧。以上安装顺序遵循的是：逐级排放气泡和仪器内存留的洗液，使得安装后气泡极难混入。本人曾试验梯度洗脱连续一周，第一针与最后一针主成分保留时间相差在6秒以内。  四、 试验后色谱柱的清洗1.最为常用的C8柱、C18柱1.1 流动相仅为乙腈-水或甲醇-水时继续冲洗30分钟，流速1.0ml/min，柱温保持试验时温度，即可。1.2 水相中有无机盐、表面活性剂或三乙胺、高氯酸等物质时先采用纯水（或含有2%甲醇），冲洗A管路（试验采用哪个管路，就要从头到尾冲洗该管路），时间30分钟（如流动相中有表面活性剂，适当增加时间），流速1.0ml/min，柱温可较试验温度高出5~10℃；随后更换成20%甲醇再冲洗30分钟，流速1.0ml/min，柱温箱加热装置关闭。结束后取下色谱柱放置阴凉处。很多同仁其后采用高比例的甲醇冲洗，实属画蛇添足，导致残余的有机相中水相遇到高比例的甲醇后析出少量盐和表面活性剂，从而在泵头上、色谱柱中析出，也导致了色谱柱寿命大为缩短。本人曾使用过一根约2000元的色谱柱，正着用了四年、倒着用了两年（倒着用测非有关物质）。2. 其他类型色谱柱查询获取如何科学合理地使用与清洗保存该类型色谱柱的方法，切勿盲动，否则导致色谱柱性能急剧下降。五、 试验顺序工作流程应如下进行：(1) 0~2小时 配制流动相、对照品和供试品溶液等，切勿催促昨日试验同事。(2) 2~3小时 采用A管路注入流动相（B、C、D管路一般不用，除非梯度洗脱才用到B管路），平衡1小时。如流动相中有表面活性剂，建议前一晚小流速过夜，第二天上班后将流速增至1.0ml/min，平衡1小时后即可开始做试验。(3) 3~5小时 测定空白溶剂，一定要做到基线不漂移后方可开始测定。所谓“不漂移”，通常系指以1.0%自身对照溶液主成分峰高约20%高度来设定的视野范围观察所得，切不可设定得过小，使得杂质峰显得很突兀、基线抖动得很厉害，弄得人很担心。(4) 5~8小时 配制完所有样品，预试了对照溶液和供试品溶液，设定好自动进样程序，程序最后一针设定为小流速过夜，紫外灯关闭。切勿设定为切换至B管路洗脱，此举得不偿失。(5) 9~24小时 放心回家，让仪器自动进样，除非不稳定的样品（配制一份测定一针）。充分利用下班后的16小时，做到从容不迫、镇定自若。如单位还无自动进样装置，建议向领导申请购买，因一台自动媲美三台手动。(6) 第二天0~0.5小时 检查并计算昨晚试验结果，如发现不良记录，将流速增至1.0ml/min，平衡30分钟后，测定重新配制的该份样品即可（同时回校对照一针）。无需全部重新测定，不要过度谨小慎微。(7) 第二天0.5~2.0小时 如上冲洗色谱柱，交给其后试验同事。六、 液相软件的使用现今几大主流品牌的硬件性能已相差无几，主要还是软件的设计是否能使操作者得心应手、随心所欲。建议掌握各软件的批处理、编辑样品处理模板等功能，做到一劳永逸，让软件充分为工作所用。“磨刀不误砍柴工”：本人曾用20分钟完成500个溶出度样品数据处理，做出溶出曲线图。体会一下~七、 其他1.如需使用正相系统，一定要单独采用一台仪器（如二手的、较为破旧的、淘汰的等），切勿采用异丙醇转换，此举对仪器损伤极大。2. 正相所使用的流动相（如正己烷、环己烷等），无需抽滤，混匀超声后即可使用，“大道至简”。3. 柱温箱必须配制。如欲经济，可购买国产柱温箱

       1) 流动池内有气泡　　如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许多线状“峰"，这是由于系统内有气泡，需要对流动相进行充分的除气，检查整个色谱系统是否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡。如果气泡停留在流动池内，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的办法除去气泡(最好不连接色谱柱);或者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出口，使池内增压，然后放开。可反复操作数次，但要注意不使压力增加太多，以免流动池破裂。　　2) 流动池被污染　　无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶性;如果污染严重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗、更换窗口。　　3) 光源灯出现故障　　紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时，可能产生严重噪音，基线漂移，出现平头峰等异常峰，甚至使基线不有回零。这时需要更换光源灯。　　4) 倒峰　　倒峰的出现可能是检测器的极性接反了，改正后即可变成正峰。用示差折光检测器时，如果组分的折光指数低于流动相的折光指数，也会出现倒峰，这就需要选择合适的流动相。如果流动相中含有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时，无吸收的组分就会产生倒峰，因此必须用高纯度的溶剂作流动相。在死时间附近的尖锐峰往往是由于进样时的压力变化，或者由于样品溶剂与流动相不同所引起的。

液相色谱仪是分析工作者常用的“一门技术”。本人深感何时能将液相做到有“打游戏”感觉时，便是到了游刃有余、驾轻就熟的境界。现今的液相软件均已具备了强大的数据处理功能，如能庖丁解牛般使用，便可将此测定做到事半功倍、轻松自如。一、 水相中的溶质溶解方式水相中需溶解的无机盐和表面活性剂等固体溶质，建议采用加热法，不建议采用振摇、超声等方式。因此种方式的溶解，溶质可能处于“临界胶团浓度”，其后一旦遇到某特殊情形（如遇有机溶剂、温度剧降等），极易析出少量结晶；而一旦析出，便将损伤仪器和色谱柱，呈现泵头处析出“盐和白粉”的现象。二、 流动相的配制与使用1. 恒度洗脱一定是将水相与有机相混合后、抽滤（使用混合型过滤膜），用一个管路（如A管）泵入仪器，这是使用的原则。切勿因节约有机相、便于摸索色谱条件等原因而使用两个管路（一个纯水相、一个纯有机相）泵入仪器，即便配制了脱气机。因此种情形极易造成水相中盐和表面活性剂的少量析出。剩余流动相完全可继续使用，密封后放置阴凉处；待下次试验时与新配制的流动相混合后抽滤即可。无需担心发霉、无机盐析出、挥发、比例不准等问题，这些皆为疑神疑鬼的表现。实践是检验真理的标准！实践吧~2. 梯度洗脱流动相配制最为科学的方式是：A相为高比例的水相-低比例的有机相、B相为低比例的水相-高比例的有机相（英国药典几乎均如此）；其次为：A相为高比例的水相-低比例的有机相、B相为纯有机相；最不科学的为：A相为纯水相、B相为纯有机相，如既有质量标准采用了此种方式，建议改为第二种或第一种方式，否则基线漂移严重，难以进行稳定的杂质检测。梯度洗脱结束后，建议经5分钟回到初始状态，再平衡5分钟后开始下一针测定。这10分钟的稳定极为关键。切勿短时间内回到初始状态，会对仪器和色谱柱损伤较大。三、 色谱柱的安装标准SOP应为：取A管路放入流动相瓶中→拧松泵头→流速由0ml/min逐渐升至10ml/min，观察尾液是否呈瀑布状流出，持续10秒→拧紧泵头→流动相呈抛射状从安装色谱柱的一端喷出，观测是否呈抛物线状，持续5秒→流速逐步降至1.0ml/min →安装色谱柱，待20秒后，流动相从色谱柱另一端呈泉水状涌出再安装另一端→手握两端螺丝帽，拧紧。以上安装顺序遵循的是：逐级排放气泡和仪器内存留的洗液，使得安装后气泡极难混入。本人曾试验梯度洗脱连续一周，第一针与最后一针主成分保留时间相差在6秒以内。  四、 试验后色谱柱的清洗1.最为常用的C8柱、C18柱1.1 流动相仅为乙腈-水或甲醇-水时继续冲洗30分钟，流速1.0ml/min，柱温保持试验时温度，即可。1.2 水相中有无机盐、表面活性剂或三乙胺、高氯酸等物质时先采用纯水（或含有2%甲醇），冲洗A管路（试验采用哪个管路，就要从头到尾冲洗该管路），时间30分钟（如流动相中有表面活性剂，适当增加时间），流速1.0ml/min，柱温可较试验温度高出5~10℃；随后更换成20%甲醇再冲洗30分钟，流速1.0ml/min，柱温箱加热装置关闭。结束后取下色谱柱放置阴凉处。很多同仁其后采用高比例的甲醇冲洗，实属画蛇添足，导致残余的有机相中水相遇到高比例的甲醇后析出少量盐和表面活性剂，从而在泵头上、色谱柱中析出，也导致了色谱柱寿命大为缩短。本人曾使用过一根约2000元的色谱柱，正着用了四年、倒着用了两年（倒着用测非有关物质）。2. 其他类型色谱柱查询获取如何科学合理地使用与清洗保存该类型色谱柱的方法，切勿盲动，否则导致色谱柱性能急剧下降。五、 试验顺序工作流程应如下进行：(1) 0~2小时 配制流动相、对照品和供试品溶液等，切勿催促昨日试验同事。(2) 2~3小时 采用A管路注入流动相（B、C、D管路一般不用，除非梯度洗脱才用到B管路），平衡1小时。如流动相中有表面活性剂，建议前一晚小流速过夜，第二天上班后将流速增至1.0ml/min，平衡1小时后即可开始做试验。(3) 3~5小时 测定空白溶剂，一定要做到基线不漂移后方可开始测定。所谓“不漂移”，通常系指以1.0%自身对照溶液主成分峰高约20%高度来设定的视野范围观察所得，切不可设定得过小，使得杂质峰显得很突兀、基线抖动得很厉害，弄得人很担心。(4) 5~8小时 配制完所有样品，预试了对照溶液和供试品溶液，设定好自动进样程序，程序最后一针设定为小流速过夜，紫外灯关闭。切勿设定为切换至B管路洗脱，此举得不偿失。(5) 9~24小时 放心回家，让仪器自动进样，除非不稳定的样品（配制一份测定一针）。充分利用下班后的16小时，做到从容不迫、镇定自若。如单位还无自动进样装置，建议向领导申请购买，因一台自动媲美三台手动。(6) 第二天0~0.5小时 检查并计算昨晚试验结果，如发现不良记录，将流速增至1.0ml/min，平衡30分钟后，测定重新配制的该份样品即可（同时回校对照一针）。无需全部重新测定，不要过度谨小慎微。(7) 第二天0.5~2.0小时 如上冲洗色谱柱，交给其后试验同事。六、 液相软件的使用现今几大主流品牌的硬件性能已相差无几，主要还是软件的设计是否能使操作者得心应手、随心所欲。建议掌握各软件的批处理、编辑样品处理模板等功能，做到一劳永逸，让软件充分为工作所用。“磨刀不误砍柴工”：本人曾用20分钟完成500个溶出度样品数据处理，做出溶出曲线图。体会一下~七、 其他1.如需使用正相系统，一定要单独采用一台仪器（如二手的、较为破旧的、淘汰的等），切勿采用异丙醇转换，此举对仪器损伤极大。2. 正相所使用的流动相（如正己烷、环己烷等），无需抽滤，混匀超声后即可使用，“大道至简”。3. 柱温箱必须配制。如欲经济，可购买国产柱温箱

色谱工作者常会碰到这样的问题，什么时候该换色谱柱了? 色谱柱的塔板数能体现色谱柱的状态吗?确定表明一支色谱柱应该“退休"的标准，从经验来看，当一支色谱柱的塔板数降低到新柱子时的百分之多少时就可以认为该色谱柱不能再使用了呢?只看塔板数作为评价色谱柱质量的指标合适吗?在您的实验室里是如何判断一根色谱柱不可以再用了呢?　　塔板数是一个粗略的指标，不能作为评价色谱柱的标准。通常使用塔板数来考察色谱系统：将新柱子接到仪器上，根据色谱柱生产商提供的测试条件测试该色谱柱，你应该得到和分析报告上同样的结果。最差也应该得到比报告值低10%的塔板数。如果你所测得的塔板数远远低于厂家提供的报告数据，这就说明你的色谱系统可能存在一些问题。进样器、柱外效应、毛细连接以及检测器都是容易出现问题的地方。　　相信每个色谱工作者都会关心分辨率，分辨率是考察一根色谱柱分离具体样品的好坏程度的指标。色谱的核心任务就是为了使每个峰完成分离，我们在实际工作中需要得到合理峰宽的窄峰以便获得较低的检测限(这已经不是什么难题，现在的色谱柱都可以达到这个要求)。　　然而，我们需要考虑的另一个因素是塔板数对分辨率的影响仅仅是平方根的关系，这意味着当一根色谱柱的塔板数下降50%，分辨率仅仅下降7%。而当一根色谱柱塔板数下降为新柱子一半的时候，你肯定看到了其它更加严重的症状告诉你这根色谱柱的寿命不长了。其实，大多数用户仅仅使用色谱柱塔板数的一小部分。例如，对一支新的150mm×4.6mm，5mm粒径的色谱柱来讲，厂家测试报告上的塔板数为14,000。使用下面的公式可以估算一支色谱柱的塔板数　　N=3000*L/Dp　　L是色谱柱的柱长，以厘米为单位;Dp是填料的粒径，以微米为单位　　一支150mm×4.6mm，5mm粒径的色谱柱的柱效大约为9000，比厂家测试数据低30%。在实际的工作中，大多数色谱方法仅仅需要这些塔板数的一半，这些色谱方法还有优化的空间吗?答案是肯定的。可见，色谱柱的塔板数不是分离中最重要的参数。　　较好的方法是使用压力、分辨率和峰形的混合指标来考察一根色谱柱的状态。压力的测量是最容易的，通常我们确定的色谱方法要满足以下的要求：用新柱子时柱压不高于2500psi，在任何情况下压力都不超过3000psi。尽管现代的液相色谱系统都可在更高的压力下使用，但由于高压产生的系统损耗和泄漏的问题会很严重。当压力超过3000psi时，考虑更换进样器和色谱柱之间的0.5mm孔径的在线滤片。如果更换滤片后压力仍然高，则色谱柱的滤片或者是色谱柱已经被污染，这提示我们该换柱子了。有统计表明，超过60%的色谱柱损坏是由于压力过高的原因。　　分辨率是我们考察色谱柱的一个非常重要的指标，只要两个组分可以获得基线分离，对该分析物的定量就不会有什么问题。对于对称的高斯峰来讲，1.5的分辨率即可得到基线分离;若Rs在1.7至2.0之间则更好。若峰拖尾严重则需要更高的分辨率。使用分辨率作为色谱柱的评价指标的好处在于我们可以直观地看到相邻的峰的分离情况。　　另外一个考察色谱柱质量的标准是峰形拖尾情况，厂家测试报告的峰形都非常漂亮，但这并不代表该色谱柱分析实际样品的情况。实际样品中总是含有或多或少引起峰形拖尾的组分。含有氮原子的化合物，这些化合物和硅胶骨架上的游离硅羟基结合非常紧密，随着色谱柱使用时间越长，键合相流失，拖尾则更加严重。然而拖尾情况的改变不像分辨率的改变那样能够马上看出来。基于此，最好定一个拖尾因子的上限，如美国药典规定拖尾因子不超过1.8。　　确定色谱柱“抛弃"标准的最佳时间是当我们开发分析方法或作方法认证的时候。通常，在开发分析方法的过程中你会试验几根色谱柱，分析足够多的实际样品，你知道当分离变差的时候是什么样的情况。我倾向于在开始时使用一个宽的范围。我们的经验是这样的：你如果在开始时紧缩系统适用性要求，在方法认证后再放宽这个要求是很困难的。在分析实际样品之前进行系统适用性考察，以确保该色谱方法满足分析者可以接受的标准。色谱性能综合指标下降到一定程度，需要换新柱子之前，当然还得首先考虑用清洗和再生的方法尝试恢复色谱柱的性能，清洗和再生的方法用了，色谱性能还不行才考虑换新柱子。否则，譬如由于堵塞引起的柱压升高等小问题，稍稍反冲一下就可简单解决的，就犯不着要换新柱子了。