IF=24.3|首次发现！国产纳米孔测序助力揭示头孢地尔异质性耐药新机制

肺炎克雷伯菌是临床重要的机会致病菌，其中序列11型（ST11）在中国流行。更为重要的是，高毒力多耐药ST11型肺炎克雷伯菌的快速出现和广泛传播已对公共卫生造成了严重威胁。

头孢地尔是（cefiderocol）一种新型铁载体结合头孢菌素，对革兰氏阴性菌效果显著。目前，头孢地尔尚未在中国上市，本研究则基于国产纳米孔测序平台-QNome，首次揭示了在中国临床菌株中发现的耐药基因bla_SHV-12发生串联重复和扩增所致头孢地尔耐药的新机制，提示我们需要加强细菌耐药的基因组学监测。

基于前期主动基因组监测，本研究发现两例感染肺炎克雷伯菌的患者，其均未发生过头孢地尔的暴露，却在体内和体外均获得了对头孢地尔具有异质性耐药的菌株。

基于齐碳科技纳米孔测序平台，研究团队对纳米孔长读长测序reads进行进一步分析，并首次发现头孢地尔耐药菌株中bla_SHV-12基因所在基因元件发生串联重复、拷贝数增加，这可能是导致肺炎克雷伯菌对头孢地尔耐药的新机制，进一步应用qPCR验证了bla_SHV-12拷贝数增加，并在体外抗生素（头孢地尔）选择压力下诱导bla_SHV-12基因单拷贝菌株发生了同样的串联重复现象，验证了该耐药机制。重要的是，这种耐药性并未导致显著的适应性代价。

1.头孢地尔耐药菌株和两例相关样本

研究人员在1484株临床分离菌株中，随机选择了151株（10.2%）碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌，使用微量肉汤稀释法和Etest试验检测了头孢地尔耐药性。在151株菌株中，MIC50和MIC90分别为1 和4 mg/L，显示出较强的体外抗菌活性。两例患者均未接受过头孢地尔治疗。从这两例样本共分离得到7株菌，每个样本各有1株表现为头孢地尔耐药，全部纳入后续分析。大蜡螟试验中7株菌株均表现为高毒力。

Fig. 1.FDC-resistant isolates and the infection cases.

2.质粒携带的bla_SHV-12基因扩增与头孢地尔耐药相关及其验证

研究人员使用齐碳纳米孔测序结合二代测序获得了这些菌株的染色体和质粒完整序列。

系统发育分析显示，这些菌株均属于ST11型，但可分为两个进化分支，相互之间存在64个核心基因组SNP差异位点。

Fig. 2.Sequence alignments of bla_SHV-12 bearing IncR/IncFII plasmids from the two patients. 

随后，研究人员单独利用QNome测序平台直接分析了纳米孔测序的读段，来进一步解析bla_SHV-12基因扩增情况。并使用逆转录qPCR和qPCR分别检测了bla_SHV-12基因的表达情况和该基因相对于IncR/IncFII质粒上单拷贝基因virB的拷贝数（图3）。

通过上述验证实验结果表明，IncR/IncFII质粒上bla_SHV-12基因扩增导致的基因拷贝数增加可能是头孢地尔耐药性出现的原因。

Fig. 3.Amplification of bla_SHV-12 associated with FDC resistance.

3.体外头孢地尔选择压力下bla_SHV-12基因的扩增

为验证bla_SHV-12基因扩增是否能够被诱导得到并导致头孢地尔耐药，研究人员使用样本1分离的第一株携带单拷贝bla_SHV-12基因、头孢地尔敏感菌株Kp1_1，在头孢地尔压力下进行连续传代诱导，将菌株分别在3个低于头孢地尔MIC的浓度下（0.5，1，2 mg/L）培养72小时。

Fig.4. bla_SHV-12 amplification under FDC selective pressure in vitro.

实验结果表明，低浓度头孢地尔不能诱导明显的bla_SHV-12基因扩增，而高浓度可诱导快速而显著的基因扩增和拷贝数增加，导致更高的MIC。值得注意的是，未发现bla_SHV-12基因拷贝数和头孢地尔MIC之间的显著线性关系。在上述实验中，在未添加头孢地尔的对照组中未发现bla_SHV-12基因拷贝数和头孢地尔MIC的变化。

通过主动监测，研究人员发现碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌菌株中，头孢地尔耐药并不常见。但在本研究中，研究人员基于齐碳纳米孔测序平台，利用纳米孔测序技术对连续长DNA片段测序的出色表现，首次在ST11型全耐药高毒力菌株中，报道了IS26介导的bla_SHV-12基因串联扩增导致的头孢地尔耐药的宿主内进化。

近年来，沈宁教授研究团队在临床中肺炎克雷伯菌的耐药、毒力和传播相关研究领域不断产出。本研究是继此前成果发表在《Lancet Microbe》（该成果基于齐碳QNome测序平台完成，点击跳转查看原文）、《Microbiology Spectrum》和《Virulence》等高水平杂志后，在临床重要耐药菌新型耐药机制研究领域的又一个突破。

此次研究发现不仅是对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌流行病学和头孢地尔异质性耐药研究的有效补充，也为临床多重耐药研究提供了更多的理论科学依据。

参考文献：

[1]Chao Liu, Juan Yi, Ming Lu, Ping Yang, Chunjing Du, Fan Jiang, Pengcheng Du, Ning Shen,Dynamic within-host cefiderocol heteroresistance caused by blaSHV-12 amplification in pandrug-resistant and hypervirulent Klebsiella pneumoniae sequence type 11,Drug Resistance Updates,Volume 73,2024,101038,https://doi.org/10.1016/j.drup.2023.101038.

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