法医学1区Top期刊|基于国产纳米孔测序平台探索新型单倍型遗传标记的法医学应用

微单倍型（Microhaplotype，MH）兼具STR和SNP遗传标记的优点，具有多态性好和突变率低等优势；同时有效地避免优势扩增和stutter峰的缺点。MH在法医遗传学领域的潜在应用价值已被国内外多项研究证实。

在前期研究中，四川大学侯一平教授团队已基于国产纳米孔检测平台-QNome完成MH的检测稳定性、数据准确性以及分析便捷性的初步研究。在此基础上，该团队提出片段长度约800bp，且至少包含5个SNPs的新型法医标志物—MiniHap。

更多的SNPs则意味着包含更多的遗传信息，具有更高的有效等位基因数(the effective number of alleles, Ae)和信息量（Informativeness，In）；这将是较为理想的法医学新型遗传标记，在法医学系谱分析、物地理祖源推断、混合DNA检验等方面具有较高的应用潜力。

研究团队联合齐碳科技生信团队研发了mMHtyper（https://github.com/willow2333/mMHtyper），为分析MiniHaps这一新型遗传标记提供了可靠的生信工具。

研究团队从千人基因组中筛选出56个MiniHaps；并基于中国5个群体探索MiniHaps在生物地理祖源推断中的应用价值。

Fig. 1. The work flowchart of the nanopore sequencing data analysis pipeline. 

1. MiniHap的选择

根据筛选标准从千人基因组数据库中筛选出78个MiniHaps。这些miniHap通过预实验及条件过滤最终剩余56个MiniHaps用于法医生物地理祖源推断。这些MiniHaps分布在19条常染色体上，其扩增产物平均长度为819 bp。每个MiniHap中的SNP数量从5个到17个不等，共计519个有效SNP位点。

2.测序性能表现

测序结果显示，平均映射读数数量为466,113个，有效读数比率 (映射读数/总读数) 大多在90%以上。用于评估新构建的MiniHaps panel和 QNome 平台的测序性能指标包括DoC（The depth of coverage）、LB（locus balance）、HB（heterozygote balance）和噪声，结果表明MiniHap panel在QNome测序平台上整体表现良好。

Fig. 2. Sequencing performance of the 56 MiniHaps using QNome device. (A) Heterozygote balance (HB) for the 56 MiniHaps. (B) Noise for the 56 MiniHaps.

3.等位基因（单倍型）频率和法医统计参数

研究团队对来自中国5个人群的196名个体中的56个MiniHaps进行了基因型分型，并观察到2474种不同的单倍型。

Fig. 3. The number of reported alleles and power of discrimination (PD) for the 56 MiniHaps.

56个MiniHaps中MiniHap-04位点的多态性最高，共报告了148个单倍型（Ae值66.9268），其次是MiniHap-38和MiniHap-47位点，报告了110个单倍型（Ae值分别为46.1731和32.4871）。56个MiniHaps的平均Ae值为12.1608，其中38个（67.86%）Ae值大于7.0000（Ae值越高，混合DNA解析效力就越大）。此外，研究团队还对包括GD、PIC、PD、PE、TPI和In值在内的法医学统计参数进行了验证研究（表S5）。

Table S5.  Forensic statistical parameters of 56 MiniHaps for the Chengdu Han, Chengdu Tibetan, Hainan Han, Hainan Li, Liangshan Yi and combined populations.

以上数据结果表明，大多数筛选出的MiniHap位点不仅适用于个体识别和亲子鉴定，还在混合DNA解析和祖源推断方面表现出较高潜力。

4. 群体遗传分析和祖源推断

研究团队根据合并的56个MiniHaps数据，计算了本研究中五个人群和全球26个人群之间的成对遗传分化指数FST值，并基于FST矩阵和单倍型频率，对来自31个种群的2700个个体样本进行了遗传多样性评估（系统发育分析和和PCA主成分分析）。为进一步分析祖先成分，团队使用基于模型的聚类软件STRUCTURE评估了祖先成分及其比例。

值得注意的是，进化树呈现出四个主要分支：东亚分支、南亚分支、欧洲-美洲分支和非洲分支，本研究的人群与东亚人群聚集在一起，并与东亚人间表现出很强的遗传相似性（平均FST值为0.0161），而与非洲人遗传距离最大（平均FST值为0.0398），证明MiniHap在洲际间祖源推断方面表现出卓越的性能，其效能与Precision ID Ancestry Panel（165个SNPs）相媲美。然而该方法在区分洲际内/同一语系的亚群方面不够有效，这可能是在标记选择过程中参考群体数据库中数据不足所致。因此，建立一个更全面的、有足够参考人口数据的数据库显得更为迫切。

Fig. 4. Population genetic analysis and ancestry components inference among our five studied populations and 26 worldwide populations. (A) The phylogenetic tree was constructed based on the FST matrix with the neighbor-joining method. (B~D) The PCA plots based on the top three components among the 31 populations. (E) Ancestry component inference among the 31 populations was performed based on the haplotype data of the 56 MiniHaps (K = 5). The population full names are displayed in Table S1.

近年来，纳米孔测序技术发展迅速，其对连续长DNA片段测序和获取相位信息的出色表现备受瞩目。在本次原理验证研究中，研究团队基于齐碳QNome纳米孔测序平台对新型遗传标记MiniHaps进行了验证，结果表明其在祖源推断方面具有卓越表现和无限潜能。

研究团队最后指出，虽然研究结果显示MiniHaps在洲际内/同一语系的亚群体间区分效果表现不佳，推测有可能是在标记选择期间数据库中缺乏足够的参考人群数据，但也因此证实，建立一个更全面的人群基因组测序数据库对未来筛选出更合适的MiniHaps显得尤为迫切，这也将有利于纳米孔测序技术应用于祖源推断领域的深入研究和新工具的不断优化。

第一作者简介：

四川大学华西基础医学与法医学院刘京博士后为该论文第一作者，其为四川大学-丹麦哥本哈根大学联合培养的法医学博士（CSC公派）。刘京博士的主要研究方向为新型法医学遗传标记的探索研究和高通量测序技术（包括新一代测序和纳米孔测序）的法医学应用研究。本项工作得到了“十四五”国家重点研发计划、国家自然科学基金重大项目以及中国博士后科学基金的资助。

特别鸣谢四川大学华西基础医学与法医学学院的侯一平教授团队对本文的指导！

参考文献：

[1]Liu J, Li S, Su Y, Wen Y, Qin L, Zhao M, Hui M, Jiang L, Chen X, Hou Y, Wang Z. A proof-of-principle study: The potential application of MiniHap biomarkers in ancestry inference based on the QNome nanopore sequencing. Forensic Sci Int Genet. 2023 Oct 17;68:102947. doi: 10.1016/j.fsigen.2023.102947. Epub ahead of print. PMID: 37862770.

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