法医遗传学重磅成果！基于国产纳米孔测序平台发布线粒体DNA控制区异质性检测分析全流程—CmVCall

线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是真核生物中独立于核基因组之外的遗传物质，呈闭环双链结构，具有母系遗传、多拷贝、异质性阈值效应及变异率较高等特点。由于mtDNA 特殊的遗传特征和环状分子结构，mtDNA检测分析在法医学、群体遗传学、人类生态学、分子进化和考古学有重要的应用意义。

mtDNA序列及异质性分析在很大程度上依赖于测序技术。Sanger测序由于流程相对繁琐、分辨率较低、通量不足；在mtDNA异质性应用中往往受限。下一代测序技术（NGS）本质为短读长测序，分析mtDNA需要拼接多个短片段扩增子，扩增效率对异质性比例的识别存在潜在影响。此外，短片段扩增的非特异性容易受到核线粒体DNA（nuclear mitochondrial DNA，NUMT）序列的影响，从而使mtDNA分析变得复杂。

作为最新一代基因测序技术，纳米孔测序可利用其读长长、实时测序的天然优势改善或避免以上限制，为异质性检测提供全新的方法和见解。目前，纳米孔测序技术的应用已在多个临床和生物学领域得到了开发，然而，利用该技术进行mtDNA异质性检测的研究报道却还很少。

作为国内首家自主研发纳米孔基因测序技术的齐碳科技，QNome平台已被应用于各种生物学研究，平台在微单倍型遗传标记的分型研究结果已发表于Forensic Science International: Genetics (2022, 57, 102657)，其法医适用性也得到了初步证实。（点击此处即可跳转阅读原文）

此次，侯一平教授团队基于齐碳QNome平台，进一步开展纳米孔基因测序技术在线粒体基因组研究的应用探索，以期改善传统测序技术带来的局限性，获得更高准确性的检测结果。

研究团队首先评估了四种常用的variant callers在人类mtDNA控制区异质性认证中的性能，基于模拟混合两个合成序列( rCRS 和SSHS)样本的QNome纳米孔测序reads产生的不同比例（50:50, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10, 95:5）的混合样本。

随后，基于QNome测序平台自主开发了mtDNA控制区异质性检测分析框架—CmVCall，该工具整合了多个数据处理程序，可执行读取过滤、去除核线粒体序列（numt）、比对、可选择的“校正”模式和最终的异质性识别，并验证了其在低异质性水平上的表现。

Fig1 CmVCall pipeline. 

同卵双胞胎（MZ）由于特殊的胚胎发生机制，具有极其相似的遗传特征。从早期的遗传“共识（一致性）”角度来看，他们的遗传信息甚至是完全一样的，无法通过常规的法庭科学DNA检测手段来区分，也对法医调查提出了挑战。在本研究中，为了探究纳米孔测序技术在双胞胎线粒体异质性识别中的潜力，研究团队还使用来自同卵双胞胎（MZ）的血液、唾液和毛发样本进行异质性检测评估，并与NGS平台数据进行比较。

1.纳米孔测序结果表明CmVCall具有很高的准确性，可用于纳米孔测序数据mtDNA控制区的异质性检测。使用“无校正”选项，pipeline可以检测到低至10%的异质性水平，而使用“校正”选项，可以准确识别5%的低频异质性位点，精度、准确性和召回率分别为100%、99.9%和92.3%。

Fig.2Accuracy, precision, and recall of six simulation ratios with ‘No correction’

Fig.3. Accuracy, precision, and recall of six simulation ratios with ‘Correction’

2. 人类线粒体基因组中多聚物（homopolymer）区域的分析一直是生物信息分析学研究中的一个挑战。以往的研究在检测异质性时，通常会丢弃这些区域。为了减少这些区域的错误率，测序生化体系和分析工具均在不断改进中。本研究中，通过纳米孔测序结合pipeline工具的严格过滤，避免了数据分析过程中不必要的“丢弃”，从而获得更高水平的个体间和个体内多态位点。

将QNome平台和Ion Torrent 平台产生的测序数据进行对比，结果显示，两个平台的异质性调用呈现一定程度的一致性。纳米孔测序基于“校正”模式可以比NGS平台识别出更多的异质性，并在具有高覆盖率的多聚物区域也识别出异质性位点，显示出纳米孔测序技术的应用潜力。

3.研究团队统计了每对双胞胎三种类型样本之间的mtDNA控制区微小差异。结果表明基于NGS数据，四对MZ双胞胎的两个体可以通过毛发样本的异质性位点被区分开来，而基于QNome校正数据，双胞胎样本的三种样本类型的mtDNA控制区检测出更多的异质性，可以区分全部7对双胞胎样本中的两个体。

Fig. 6. The accuracy, precision, and recall of four analytical tools (CmVCall, LoFreq, LongShot, and marginAlign) under six simulation ratios. This figure is based on QNome correction data.

综上所述，CmVCall具有很高的准确性，并且适合用于利用纳米孔测序数据进行mtDNA控制区的异质性检测。在“校正”选项下，5%水平异质性的精度、准确性和召回率分别为100%、99.9%和92.3%。在使用MZ样本的验证和比较中，结果表明，CmVCall可以比NGS能够识别到更多的异质性位点，揭示了个体间和个体内mtDNA细微差别。同时，该研究还鉴定了一些具有极高覆盖率和可信度的homopolymer异质性位点，这意味着利用纳米孔测序和CmVCall检测这些区域的异质性具有潜力。

研究团队表示，针对homopolymer区域的额外验证方法和新工具的不断开发仍然是非常必要的。此次研究的调查样本量仍然较小，预计将基于齐碳纳米孔测序技术继续使用CmVCall分析更多类型的数据集和更大的样本量以进一步进行估计和改进，相信这一工具将为未来开发针对线粒体全基因组的纳米孔测序pipeline奠定坚实基础。