将荧光母素(fluorescamine)加入鲎试剂中,可使参与凝胶反应的蛋白分子被荧光素标记上。在形成凝胶的过程中,由于蛋白分子产生聚合结构变化,结合于蛋白的荧光素因部分蛋白随水分子运动而同时发生旋转,导致荧光偏光度发生变化。令荧光偏光度为P,垂直荧光强度为I1,水平荧光强度为I2,则可见Р值由于凝胶化而增加,其值可按下式求得如下图:
Р值与标本中内毒素的含量呈线性关系。
实验时所用的荧光母素浓度常为0.02%。因为荧光母素浓度在0.05%以上时,聚合反应有明显的抑制,0.025%有轻微的抑制作用。
鲎试剂凝胶化,可以使P值增大,其反应潜伏期的长短与P值增大的程度取决于内毒素的浓度。当内毒素在10-2μg/ml时,5分钟内P值开始增大,而10-3μg /ml时,则在30分钟仍看不出P值的增大,当内毒素<10-3μg /ml时,浓度越小潜伏期越长。从而形成了P值上升的图像,据此可求出回归直线方程。
设倾斜度为b,潜伏期为t ,计算b/t值。如按不同浓度的标准内毒素计算结果绘成曲线,可见内毒素在10-8~10-3μg /ml范围内呈上升型直线,其相关系数为0.9804,方程式为:
Y = 0.0207 + 0.0797x
(R = 0.9804)
根据标准曲线,即可求出被检标本中内毒素的含量。
本试验的操作均在0℃进行,测定时则在25℃进行。应观察60分钟内反应的全过程,每隔5分钟测定一次。
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